棉籽糖改善小鼠脂毒性肝损伤的作用及机制

作     者：刘家和 

作者单位：黑龙江八一农垦大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吕红明

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：棉籽糖 NAFLD 炎症 氧化应激 脂质代谢紊乱 Nrf2信号途径 

摘      要：非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是游离脂肪酸代谢失衡所引起的一种肝脏营养代谢综合征,目前针对该疾病的发病机制及防治药物仍缺乏系统性研究。虽然脂质代谢紊乱被视为NAFLD发生的起始与核心因素,但其后续导致的炎症、焦亡、纤维化与氧化应激同样被认为是该病发展的重要病因。最近研究表明,天然化合物可通过激活Nrf2信号通路对肝脏脂肪代谢紊乱发挥重要的调控作用。棉籽糖是一种天然可食用性的寡糖,可从棉籽和甜菜等植物中提取,具有抗炎、抗氧化及调节脂质代谢等生物学功能。然而,棉籽糖改善NAFLD的潜在作用与分子机制尚未明确。蛋氨酸胆碱缺乏饮食(Methionine and Choline Deficient Diet,MCD)会导致磷脂酰胆碱合成障碍并进而甘油三酯转运受阻,最终导致脂质合成障碍,诱发NAFLD。因此,本实验通过MCD饲喂C57BL/6野生型(Wild Type,WT)和Nrf2缺失型小鼠构建NAFLD模型;同时,利用油酸(Oleic acid,OA)处理AML12细胞构建体外脂毒性模型,通过肝脏组织病理学观察、油红O染色、H&E染色、天狼星红染色、蛋白免疫印迹(Western blot,WB)、RT-q PCR等方法分别进行探究,旨在阐明棉籽糖对脂毒性的改善作用及机制,为临床上肝脏脂毒性损伤的防控提供有潜力的药物。体内实验结果表明,棉籽糖能够改善MCD造成的肝脏组织病理学损伤,促进PPARα的表达并抑制SREBP-1c的表达,调控脂肪酸的代谢。血清学检测结果发现棉籽糖同样能有效改善血清中TG、TC、HDL、LDL、AST与ALT的分泌异常。WB结果显示,棉籽糖通过下调TLR4-My D88-NF-κB信号途径进而减少HMGB1、IL-6与COX2等炎性因子的表达与分泌。此外,本实验发现棉籽糖能够抑制NLRP3炎性小体的合成并降低N-GSDMD的剪切抑制焦亡的进程。天狼星红染色结果发现棉籽糖治疗后胶原纤维沉积减少。α-SMA与TGF-β1等纤维化相关蛋白的变化与染色结果一致。氧化应激水平的检测发现,棉籽糖能够激活Nrf2/Keap1信号通路并促进下游抗氧化蛋白Cav1等表达。血清学检测得到进一步验证,GSH与SOD水平下降,MDA升高。综上,棉籽糖能够抑制脂质代谢紊乱、炎症和氧化应激等各个方面,改善肝脏脂毒性损伤。在OA诱导的AML12细胞中可发现棉籽糖通过调节SREBP-1c、FAS、PPARα的表达缓解脂质代谢异常。油红O染色与蛋白表达结果一致。棉籽糖对TLR4-My D88-NF-κB信号通路的影响与体内实验部分一致。焦亡相关蛋白的检测结果可发现NLRP3、GSDMD与Caspase-1在棉籽糖的干预下明显降低。此外,棉籽糖能够诱导Nrf2/Keap1信号通路的激活,促进Nrf2的表达。以上结果表明,棉籽糖能够有效改善肝细胞脂毒性损伤,其功能可能与Nrf2/Keap1信号通路的激活有关。为探究Nrf2与棉籽糖之间的关系,随后使用Nrf2敲除鼠进行实验。肝脏组织观察、H&E染色与油红O染色结果发现Nrf2敲除后肝脏脂肪变性与脂质蓄积现象加重,棉籽糖治疗效果减弱。WB实验与上述实验结果一致。血清学检测表明当Nrf2敲除后棉籽糖对TG与TC的清除受阻。随后对TLR4-My D88-NF-κB信号通路的检测发现,当Nrf2被敲除后,棉籽糖对下游IL-6与TNF-α的抑制效果减退。焦亡相关蛋白NLRP3、N-GSDMD与ASC等呈相似的变化趋势。此外,天狼星红染色发现当Nrf2敲除后胶原纤维沉积加剧,棉籽糖缓解效果减弱。纤维化相关蛋白表达与染色结果一致。最后,WB实验与血清学检测发现当Nrf2敲除后,HO-1与NQO1的表达被抑制,血清中GSH与SOD水平降低,棉籽糖的调节作用下降。因此,我们推测棉籽糖对肝脏脂毒性损伤的改善可能与Nrf2有关。综上所述,本实验通过构建体内外脂质代谢紊乱模型,阐明了棉籽糖改善NAFLD的作用机制。实验结果显示棉籽糖通过靶向Nrf2信号通路从而抑制脂质代谢紊乱、炎症、焦亡和氧化应激进而改善NAFLD的发生发展。