LncRNA ANRIL通过SRY/miR-146a-5p介导内皮细胞衰老微环境形成及机制研究
作者单位：中南大学
学位级别：硕士
导师姓名：柏勇平
授予年度：2022年
主 题：LncRNA ANRIL 内皮细胞衰老 血管新生 SRY miR-146a-5p
摘 要：背景:外周动脉疾病(peripheral artery disease,PAD)以外科再血管化治疗为主,但部分老年PAD患者不能耐受手术,促血管新生是其潜在治疗方式。老年PAD患者缺血下肢具有毛细血管稀疏、血管新生受损及对VEGF治疗抵抗等病理特点。因此探明衰老相关血管新生受损的机制,是亟待解决的关键科学问题。研究表明,长链非编码RNA ANRIL(antisense non-coding RNA in the INK4 locus,ANRIL)是INK4基因的反义序列,参与多种衰老相关疾病的病理生理过程,如介导平滑肌细胞衰老调控动脉粥样硬化;通过招募抑制性多梳蛋白复合物2(polycomb repression complex 2,PRC2)调控细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p15(cyclin dependent kinase inhibitor p15,p15)抑制肿瘤增殖。然而,ANRIL在内皮细胞衰老中的作用和机制尚不明确。目的:探索ANRIL在人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)复制性衰老模型中的作用和机制。方法:1)构建HUVECs复制性衰老模型,采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-q PCR)和荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)检测ANRIL在年轻ECs和衰老ECs中的表达及细胞定位。2)细胞转染技术敲降衰老ECs ANRIL,采用β-半乳糖苷酶染色法(senescence associatedβ-galactosidase,SABG)检测衰老细胞比例;蛋白质印记法(western blot,WB)检测细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂p21(cyclin dependent kinase inhibitor p21,p21)蛋白表达;RTq PCR检测衰老分子标志物及衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype,SASP)m RNA表达;采用细胞计数实验(cell countiing kit-8,CCK-8)、ki67免疫荧光实验、划痕和成管实验检测敲降ANRIL后,观察ECs的增殖、迁移和血管新生能力。3)细胞转染技术过表达ANRIL,采用SABG检测衰老细胞比例;RT-q PCR检测衰老分子标志物及SASP m RNA表达;免疫荧光检测磷酸化的组蛋白H2AX(H2A histone family member X,γ-H2AX)表达;细胞成管实验检测过表达ANRIL对ECs血管新生的影响。4)敲降ECs ANRIL后进行转录组差异基因富集分析并采用RTq PCR对相关通路进行验证。5)ECs敲降ANRIL后过表达miR-146a-5p,采用免疫荧光检测γ-H2AX表达;SABG检测衰老细胞比例。6)采用细胞转染技术干预ECs ANRIL,构建干预后的ECs与巨噬细胞共培养体系;后者与未进行处理的ECs混合进行体外成管实验,观察共培养巨噬细胞对ECs血管新生的影响;并通过RT-q PCR技术检测共培养后巨噬细胞VEGF和miR-146a-5p m RNA表达。采用转染技术干预ECs ANRIL及miR-146a-5p,将干预后的ECs与巨噬细胞共培养;将后者与未进行处理的ECs混合进行体外成管实验,观察共培养巨噬细胞对ECs血管新生的影响。7)采用“PROMO软件预测可能与编码miR-146a-5p的宿主基因启动子区域结合的转录因子。8)RNA结合蛋白免疫共沉淀技术(RNA binding protein immunoprecipitation,RIP)获得与转录因子SRY蛋白结合的RNA,RT-q PCR检测ANRIL的表达水平。9)敲降SRY,采用RT-q PCR技术检测ECs miR-146a-5p及SASP的m RNA表达;采用SABG检测衰老细胞比例;采用WB和免疫荧光检测γ-H2AX蛋白表达。10)采用转染技术干预ECs ANRIL和SRY,构建干预后ECs与巨噬细胞共培养体系,将后者与未进行处理的ECs混合进行体外成管实验,观察共培养巨噬细胞对ECs血管新生的影响。结果:1)ANRIL在衰老ECs细胞质中表达升高。2)与siCtrl组相比,si ANRIL ECs组衰老细胞比例减少;p21蛋白表达下调,p15、p16(cyclin dependent kinase inhibitor p16,p16)和p21的m RNA表达下调;ECs增殖、迁移和成管能力升高。3)与空载质粒相比,过表达ANRIL ECs组衰老细胞比例增加;p16、IL-6和IL-8 m RNA水平显著上调;γ-H2AX阳性细胞比例增多;血管新生能力明显受到抑制。4)siCtrl与si ANRIL ECs组的转录组结果显示,两组差异基因主要富集于与炎症相关的通路,如NF-κB、TNF-α信号通路。5)与siCtrl组相比,si ANRIL组miR-146a-5p表达下调;si ANRIL后过表达miR-146a-5p,γ-H2AX阳性细胞比例增加;衰老细胞比例增加。6)干预ANRIL的ECs与巨噬细胞共培养,后者与未进行处理的ECs混合后进行体外细胞成管实验,与siCtrl组相比,si ANRIL组共培养的巨噬细胞VEGF表达上调,miR-146a-5p表达下调,并促进ECs成管;与si ANRIL+oemiRCtrl组相比,si ANRIL+oemiR-146a-5p逆转si ANRIL促成管效应。与oe Ctrl组相比,oe ANRIL组共培养的巨噬细胞VEGF表达下调,miR-146a-5p表达上调,并抑制ECs成管;与oe ANRIL+simiR-Ctrl组相比,oe ANRIL+simiR-146a-5p挽救oe ANRIL抑制成管效应。7)“PROMO软件预测结果显示,转录因子SRY可能与miR-146a-5p宿主基因MIR3142的启动子区域结合。8)RIP结果显示,与年轻ECs相比,在衰老ECs中与SRY结合的ANRIL表达升高。9)与siCtrl相比,si SRY组ECs miR-146a-5p表达下调,SASP m RNA表达下调;衰老细胞比例明显下调;γ-H2AX蛋白表达下调;γ-H2AX阳性细胞比例下调。10)与siCtrl组相比,与si SRY ECs共培养的巨噬细胞促进未进行处理的ECs成管;与oe Ctrl组相比,与oe ANRIL ECs共培养的巨噬细胞抑制未进行处理的ECs成管;与oe ANRIL+si SRYCtrl组相比,oe ANRIIL+si SRY共培养的巨噬细胞可挽救oe ANRIL抑制成管效应。结论:ANRIL通过SRY/miR-146a-5p介导内皮细胞衰老微环境。(图10幅,表8个,参考文献115篇)
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