萝卜硫素（SFN）对呕吐毒素诱导猪肠道损伤的缓解作用及机制分析

作     者：侍笑如 

作者单位：扬州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：吴正常;魏宗友

授予年度：2023年

学科分类：090502[农学-动物营养与饲料科学] 0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：猪 呕吐毒素 萝卜硫素 缓解作用 自噬 

摘      要：真菌毒素是丝状真菌自然产生的具有潜在毒性作用的次生代谢产物,严重影响人类健康和畜禽生产,其中,脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)主要存在于受镰刀菌感染的谷物和饲料中,是畜禽饲料中污染率和超标率最高的一类霉菌毒素。猪是对DON暴露最敏感的农场动物,其中肠道是DON攻击的首要靶标。萝卜硫素(Sulforaphane,SFN)是花椰菜以及其他十字花科蔬菜中的一种异硫氰酸酯,被称为“抗氧化剂,具有抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡作用。为了探究天然抗氧化剂SFN缓解DON诱导猪肠道损伤的作用及分子机制,本研究分别从个体和细胞水平开展相关分析;个体水平上,采用DON和SFN联合对C57BL/6小鼠进行灌胃试验,通过苏木精-伊红(HE)染色、qRT-PCR、抗氧化酶活性检测和Western blot等方法,建立SFN缓解DON诱导肠道损伤的小鼠模型;在细胞水平上,以猪小肠上皮细胞(Porcine intestinal epithelial cell line,IPEC-J2)为研究模型,利用Trypan Blue染色、CCK8细胞活性以及F-Actin染色、流式细胞术检测,分析SFN对DON诱导细胞损伤的缓解效果,同时通过Mitotracker-red染色、ATP含量检测和mtDNA拷贝数检测,分析SFN对线粒体功能的改善作用;此外,利用RNA-seq测序筛选关键的信号通路,采用mRFP-GFP-LC3荧光探针法检测自噬流以及线粒体和溶酶体荧光染色共定位分析,并结合Western blot检测自噬相关蛋白的表达变化,评估SFN介导自噬信号通路改善DON造成的线粒体功能损伤程度,通过上述试验进一步探究SFN缓解DON诱导肠道损伤的分子机制。主要试验结果如下:1、为了探究SFN对DON诱导肠道损伤毒性的缓解作用,在文献挖掘和预实验的基础上,首先采用灌胃方法(2 mg/kg DON和4 mg/kg SFN)建立SFN缓解DON诱导C57BL/6小鼠肠道损伤模型,记录小鼠每日的体重和采食量,结果发现,SFN预处理可以显著缓解DON对小鼠体重增长的影响(P0.05);通过HE染色、qRT-PCR、Western blot以及抗氧化酶检测,结果显示,与DON组相比,DON+SFN缓解组小鼠肠绒毛长度和隐窝深度均显著得到改善(P0.01),紧密连接相关基因ZO-1和Claudin的mRNA表达显著升高(P0.01),炎症通路相关蛋白(p-P38和p-Erk)以及炎症通路相关基因(IL-6、IL-1、TNF-α)的表达水平显著降低(P0.01或P0.05),LDH和MDA的活性出现显著下降,SOD、GSP-PX和CAT的活性也得到了恢复(P0.01或P0.05)。由此表明,SFN对DON诱导小鼠肠道损伤具有缓解作用。2、为了探究SFN缓解DON诱导IPEC-J2细胞毒性损伤,利用1μg/mL DON处理IPEC-J2细胞24h后,添加不同浓度的SFN,设置浓度梯度(0、2、5、10 μM)以及时间梯度(4h、6h),通过CCK8检测细胞活性,筛选SFN对DON诱导IPEC-J2细胞毒性损伤缓解作用的最佳浓度和时间。结果发现,2μM SFN处理6h后,IPEC-J2细胞活性极显著提高(P0.01);利用Trypan Blue、CCK8、F-Actin染色以及流式细胞术分析SFN对DON诱导IPEC-J2细胞损伤的缓解作用。结果发现,SFN预处理后IPEC-J2细胞凋亡数量显著减少(P0.01),细胞活性显著增加(P0.01),DON+SFN组细胞骨架蛋白(F-Actin)分布显著增加。此外,缓解组细胞内ROS水平显著低于DON组(P0.01),SOD、CAT和LDH抗氧化酶活性均显著得到缓解(P0.01或P0.05)。利用Mitotracker检测线粒体形态,JC-1染色法检测线粒体膜电位,以及ATP含量和mtDNA拷贝数检测,结果显示,SFN处理可以改善DON诱导的细胞线粒体形态,缓解线粒体膜电位下降(P0.01),并且增加ATP含量(P0.01)和mtDNA拷贝数(P0.01)。以上结果表明,SFN可减轻DON诱导的IPEC-J2细胞线粒体功能障碍,进而对DON诱导的细胞毒性具有缓解作用。3、为了揭示SFN缓解DON诱导肠道损伤的分子机制,利用RNA-seq对DON处理组和SFN缓解组(DON+SFN)进行比较转录组测序。结果显示,DON组与SFN缓解组间存在1519个差异表达基因,其中SFN缓解组上调907个基因。功能注释发现,大部分基因主要参与自噬(Autophagy-animal)、P53信号通路(P53 signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)等信号通路。为了进一步探究SFN缓解DON诱导IPEC-J2细胞损伤与细胞线粒体自噬信号通路的关系,通过荧光探针法(A mRFP-GFP-LC3)、线粒体和溶酶体荧光染色共定位以及Western blot法分别测定自噬流、线粒体自噬以及自噬相关蛋白的表达水平。结果显示,SFN预处理过的IPEC-J2细胞LC3标记荧光以及融合形成自噬溶酶体荧光增强,P62蛋白表达水平降低,ATG5、ATG7、PINK1蛋白表达水平显著提高(P0.01)。此外,通过CCK-8检测Bafilomycin A1抑制自噬后SFN对DON诱导IPEC-J2细胞活性,结果发现,抑制剂处理后,IPEC-J2细胞活性被极显著逆转(P0.01);ROS含量检测结果显示,DON+SFN组细胞ROS极显著低于DON组(P0.01),抑制剂处理后,IPEC-J2细胞ROS水平出现显著上调(P0.05);流式细胞术检测结果表明,DON+SFN组细胞凋亡水平极显著低于DON组(P0.01),抑制剂处理后,IPEC-J2细胞凋亡水平也出现显著上调(P0.05)。由此表明,SFN可以通过改善线粒体自噬对DON诱导IPEC-J2细胞损伤具有保护作用。综上得出结论,SFN可缓解DON诱导的肠道屏障损伤、炎症反应以及氧化应激,对DON诱导的肠道毒性具有缓解作用;此外,SFN可显著缓解DON诱导的细胞凋亡、氧化应激、炎症反应以及线粒体结构和功能障碍,对DON诱导猪小肠上皮细胞毒性同样具有缓解作用。转录组测序结合验证表明,自噬信号通路可能在SFN缓解DON诱导的细胞损伤中发挥重要调控作用。本研究揭示了SFN缓解DON诱导IPEC-J2细胞损伤的分子机制,初步在细胞水平上探讨天然植物抗氧化剂SFN对DON细胞毒性的缓解作用,为今后将SFN作为抗DON功能性饲料添加剂或治疗药物的开发提供依据和基础。