亚砷酸钠对全反式维甲酸诱导小鼠神经干细胞分化的影响

作     者：艾合买提·艾不拉 

作者单位：新疆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：马艳;孙红光

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：神经干细胞 全反式维甲酸 亚砷酸钠 细胞分化 

摘      要：目的:观察亚砷酸钠（Na As O）对小鼠神经干细胞（NE-4C）增殖分化的影响,并探讨其对NE-4C细胞分化相关Hippo/YAP和Notch通路的影响。方法:（1）以NE-4C细胞为受试对象,用全反式维甲酸（all-trans retinoic acid,ATRA）诱导NE-4C细胞分化,采用CCK-8法测定不同浓度ATRA（0、0.5、1.0、5.0μmol/L）对细胞活力的影响,RT-PCR法检测分化相关特异性基因Nestin、Sox2、NSE、Rbfox1、βⅢ-Tubulin、GFAP和MBP m RNA的相对表达水平,以此为依据筛选ATRA最适诱导浓度,建立神经干细胞分化细胞模型。（2）在神经干细胞分化细胞模型基础上,加入Na As O干预（剂量分别为0、0.3、0.6、0.9、1.2μmol/L）,以探讨Na As O对神经干细胞分化的影响。培养7 d后,采用CCK-8法检测Na As O对细胞活力的影响;免疫荧光染色法鉴定NE-4C细胞分化状态;采用流式细胞术检测分化相关特异性标志物Nestin、NSE、βⅢ-Tubulin、GFAP阳性细胞表达率;采用Western Blot检测分化相关特异性标志物Sox2、βⅢ-Tubulin、GFAP以及Hippo/YAP信号通路核心蛋白的表达水平;采用RT-PCR检测Notch1和PS1基因的相对表达水平。结果:（1）ATRA可降低NE-4C细胞活力（P0.05）,呈浓度依赖性,细胞活力在其为0.5μmol/L时最高;RT-PCR及流式细胞术结果显示:与对照组相比,ATRA诱导组神经干细胞特异性基因Sox2、Nestin m RNA表达水平及Nestin阳性细胞表达率降低（P0.05）,神经元特异性基因βⅢ-Tubulin、NSE、Rbfox1 m RNA表达水平及βⅢ-Tubulin、NSE阳性细胞表达率升高（P0.05）,分化标志物m RNA表达及阳性细胞表达水平均在0.5μmol/L时最高,确定ATRA诱导NE-4C细胞分化的适宜浓度为0.5μmol/L,并成功建立神经干细胞分化细胞模型。（2）Na As O干预可降低ARTA诱导分化NE-4C细胞活力（P0.05）,并呈现随Na As O浓度的增加而降低的剂量-效应关系;免疫荧光法、流式细胞术结果显示:分化相关特异性标志阳性细胞比例随Na As O浓度的增加逐渐降低（P均0.05）;Western Blot结果显示:中、高浓度的Na As O（0.6、0.9、1.2μmol/L）可降低特异性标志蛋白Sox2的表达水平（P0.05）,而高浓度Na As O（0.9、1.2μmol/L）染毒组特异性标志蛋白βⅢ-Tubulin及GFAP的表达水平降低（P均0.05）;随Na As O浓度的增加LATS1、p-LATS1、SAV1、MOB1、p-LATS1/LATS1蛋白表达水平逐渐升高,而YAP、p-YAP、p-YAP/YAP蛋白表达水平逐渐降低（P0.05）,高浓度Na As O（0.9、1.2μmol/L）可降低p-YAP、p-YAP/YAP,而1.2μmol/L可升高LATS1/p-LATS1蛋白表达水平（P0.05）;Na As O可降低Notch1基因的相对表达量（P0.05）,但PS1基因的表达量几乎未受影响（P=1.78）。结论:（1）本研究成功建立ATRA（0.5μmol/L）诱导NE-4C分化细胞模型。（2）Na As O可降低ATRA诱导分化NE-4C细胞活力,并抑制NE-4C细胞向神经元分化,浓度越高对增殖和分化的抑制作用越强;Na As O可增加Hippo/YAP信号通路核心蛋白LATS1、p-LATS1、SAV1、MOB1,可降低YAP、p-YAP和Notch信号通路核心基因Notch1的表达水平,提示Na As O神经干细胞分化的抑制作用可能与Hippo/YAP和Notch1通路有关。