基于重组酶聚合酶恒温扩增联合CRISPR/Cas12a技术检测疟原虫的研究

作     者：韦华贵 

作者单位：右江民族医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：林敏

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：重组酶聚合酶恒温扩增 CRISPR/Cas12a 疟原虫 18S核糖体RNA 分子诊断 

摘      要：目的:疟疾是世界上致命的寄生虫病。显微镜是疟原虫检测的金标准方法;然而,它有几个局限性;它耗时长,需要训练有素的显微镜镜检人员,而且在混合感染时,如果疟原虫密度较低,则会出现漏检的情况。为了补充现有的诊断方法,本研究:(1)建立、优化和评估了一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的检测方法,用于四种常见疟原虫的超灵敏检测,包括Po、Pf、Pv和Pm。(2)建立、优化和评估了一种基于RPACRISPR/Cas12a的检测方法,用于恶性疟原虫的超灵敏鉴定。为了满足不同场景的要求,可以以三种不同的形式判读检测结果,包括荧光读取器(Fluorescence-based assay,FBDA)、横向流动试纸条(Lateral flow test strips,LFTS)和在紫外灯下裸眼观察(Naked eye observation,NEO)。这将为今后在该领域检测疟原虫和其他病原体提供更多参考价值。方法:从2020年至2021年,收集湖北武汉疾控中心采集的输入性疟疾患者的干血斑样本、广东省援助赤道几内亚医疗队采集自赤道几内亚比奥科岛马拉博地区的疟疾患者的干血斑样本和湖北医药学院寄生虫研究所李健博士及江苏血吸虫研究所曹俊教授赠送的疟原虫标准血斑,提取血斑中的DNA,经RT-q PCR和n PCR对疟原虫虫种进行鉴定。(1)在NCBI数据库中下载四种疟原虫的小亚基18S核糖体RNA序列,利用MEGA 6软件将四种疟原虫序列与其他寄生虫的序列进行同源比对,在四种疟原虫的同源区域设计RPA通用引物,并进行筛选;在RPA扩增的靶序列上设计四种常见疟原虫通用CRISPR/Cas12a RNA(crRNA),并进行筛选;基于扩增的目的片段,构建疟原虫重组质粒;优化RPA和CRISPR/Cas12a系统的反应体系及反应条件;建立四种常见疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a联合FBDA、LFTS和NEO三种结果展示形式的通用检测方法,并通过临床样本进行评价。(2)在NCBI数据库中下载四种疟原虫的小亚基18S核糖体RNA序列,利用MEGA 6软件将四种疟原虫的基因序列与其他寄生虫的基因序列进行同源比对,在恶性疟原虫特异性区域设计恶性疟原虫特异性引物,并进行筛选;在RPA扩增的靶序列上设计恶性疟原虫特异性crRNA,并进行筛选;基于扩增的目的片段,构建恶性疟原虫重组质粒;优化RPA和CRISPR/Cas12a系统的反应体系及反应条件;建立恶性疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a联合FBDA、LFTS和NEO三种结果展示形式的检测方法,并通过临床样本进行评价。结果:(1)成功筛选出四种常见疟原虫通用引物和通用crRNA;成功构建疟原虫重组质粒;成功建立和优化四种常见疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a联合FBDA、NEO和LFTS三种结果展示形式的通用检测方法,该检测方法灵敏度强,特异度高。基于重组质粒,四种常见疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a FBDA通用检测方法和RPACRISPR/Cas12a NEO通用检测方法的检测阈值均为1 copy/μL,而RPA-CRISPR/Cas12a LFTS通用检测方法的检测阈值为10 copy/μL。基于模拟血液样本,四种常见疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a FBDA通用检测方法的LOD为6.61 p/μL(95%CI,2.02-15.32),RPA-CRISPR/Cas12a NEO通用检测方法的LOD为7.27 p/μL(95%CI,0.25-15.93),RPA-CRISPR/Cas12a LFTS通用检测方法的LOD为7.95 p/μL(95%CI,1.83-16.99)。使用临床样本进行评估的结果显示,与金标准方法相比,四种常见疟原虫RPACRISPR/Cas12a FBDA通用检测方法的正确率为98.68%,P0.05,RPA-CRISPR/Cas12a NEO通用检测方法的正确率为96.05%,P0.05,RPA-CRISPR/Cas12a LFTS通用检测方法的正确率为92.11%,P0.05。(2)成功筛选出恶性疟原虫特异性引物和特异性crRNA;成功构建恶性疟原虫重组质粒;成功建立和优化恶性疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a联合FBDA、NEO和LFTS三种结果展示形式的检测方法,该检测方法灵敏度强,特异度高。基于重组质粒,恶性疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a FBDA检测方法、RPA-CRISPR/Cas12a NEO检测方法和RPA-CRISPR/Cas12a LFTS检测方法的检测阈值均为1 copy/μL。基于模拟血液样本,恶性疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a FBDA检测方法的LOD为3.11 p/μL(95%CI,0.86-6.02),RPA-CRISPR/Cas12a NEO检测方法的LOD为3.59 p/μL(95%CI,0.13-6.67),RPACRISPR/Cas12a LFTS检测方法的LOD为4.05 p/μL(95%CI,1.03-7.34)。使用临床样本进行评估的结果显示,与金标准方法相比,恶性疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a FBDA检测方法正确率为94.74%,P0.05,RPA-CRISPR/Cas12a NEO方法的正确率为92.11%,P0.05,RPA-CRISPR/Cas12a LFTS方法的正确率为89.47%,P0.05。结论:本研究建立了RPA-CRISPR/Cas12a联合FBDA、NEO和LFTS三种结果展示形式的检测方法,用于检测四种常见疟原虫,此外还对恶性疟原虫进行鉴定,并对其灵敏度和特异度进行评估,结果表明该检测方法灵敏度高特异度强,四种常见疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a联合FBDA、NEO和LFTS通用检测方法的LOD分别为6.61p/μL、7.27 p/μL和7.95 p/μL;恶性疟原虫RPA-CRISPR/Cas12a联合FBDA、NEO和LFTS三种鉴定方法的LOD分别为3.11 p/μL、3.59 p/μL和4.05 p/μL,该检测方法具有较好的应用前景。