用于DNA修复酶体外检测和体内成像的荧光生物传感器的研究

作     者：赵冉 

作者单位：山东师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张艳;张春阳

授予年度：2023年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080202[工学-机械电子工程] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 0802[工学-机械工程] 0836[工学-生物工程] 

主      题：荧光生物传感器 体内成像 DNA修复酶 尿嘧啶DNA糖基化酶 O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶 

摘      要：DNA对生物体的发育和功能至关重要。DNA损伤的过度积累与基因组的稳定性和完整性直接相关,并危及个体健康。紫外线、电离辐射和过氧化氢等内外源性因素会影响DNA的完整性并导致DNA损伤。受损DNA的缺陷或不准确修复可导致细胞死亡,细胞恶性转化,以及肿瘤的发生。一些DNA修复基因的遗传突变也会导致广泛的疾病,包括早衰、免疫缺陷、神经退行性疾病,以及多种癌症。细胞已经进化出了监测和修复基因组错误的复杂防御系统,在细胞周期调整的同时,DNA修复途径被激活以修复受损的DNA。DNA损伤激活的一系列细胞内反应,称为DNA损伤反应(DNA damage response,DDR),它在癌症和其他疾病的发病机制中起着至关重要的作用。DNA修复酶是一类重要的酶,它通过不同的机制识别和纠正这些DNA异常,从而维持基因组的完整性。一个典型的例子是用来修复碱基损伤的碱基切除修复(base excision repair,BER)通路,包括DNA糖基化酶、脱嘌呤/脱嘧啶(apurinic/apyrimidinic,AP)内切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶在内的多种酶参与这一途径以维持基因组的完整性。因此,DNA修复酶的研究对肿瘤的治疗、预防以及其他临床活动具有重要意义。本论文以尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)这两种DNA修复酶为研究对象,构建了可用于体外检测和体内成像的荧光生物传感器。具体内容如下:(1)构建了一个熵驱动的哑铃型DNA酶组装电路来点亮活细胞中尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG),该电路结合了熵驱动的DNA催化(entropy-driven DNA catalysis,EDC)与DNA酶生物催化剂。在这个反应中,靶标UDG切除受损的尿嘧啶碱基,导致检测探针的断裂和触发器的释放。释放的触发器可以启动下游的EDC反应,形成两个具有催化活性的DNA酶单元。由此产生的双Mg-DNA酶单元可以循环裂解荧光团与淬灭剂修饰的报告探针,产生增强的荧光信号。与线性的单层EDC放大方法相比,所提出的双层EDC-DNA酶策略表现出高信号增益,并且检测限达到8.71×10 U/m L。这种检测方法可以在室温下一步完成,不需要严格的温度控制和复杂的反应程序。它还可以用来进一步筛选UDG抑制剂,测量动力学参数,区分癌细胞与正常细胞,监测细胞内UDG的活性等。此外,该策略通过合理改变损伤位点和检测底物,还可以来检测和成像其他类型的DNA修饰酶,为生物研究和临床诊断提供一个便捷而强大的方法。(2)基于DNA修复酶介导的多引物循环扩增反应(multiple primer generation rolling circle amplification,MPG-RCA),构建了一个简单、快速、一步法检测O-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)活性的荧光生物传感器。在此策略中,MGMT存在时,可以去除发夹底物中O-甲基鸟嘌呤(O-Me G)修饰的甲基,形成限制性核酸内切酶Pvu II的催化底物5′-CAGCTG-3′。随后,Pvu II将去甲基的发夹底物裂解,生成线性探针产物。线性探针产物可以作为引物与环形探针结合,启动滚圈扩增(rolling circle amplification,RCA)反应,在UDG和APE1的辅助下生成4个短的单链DNA(single-stranded DNAs,ss DNA)。由此产生的ss DNA又可以作为诱导MPG-RCA循环的引物,从而产生大量的报告探针。报告探针与组装在Au NPs(Gold nanoparticles,Au NPs)上的Cy5信号探针杂交形成双链DNA(double-stranded DNAs,ds DNA),APE1介导循环切割,导致Au NPs上释放出大量的Cy5分子。释放的Cy5分子可以通过基于全内反射荧光(total internal reflection fluorescence,TIRF)的单分子成像技术来简单地定量。得益于UDG/APE1介导的MPG-RCA的高扩增效率和单分子检测技术的优势,该方法极其灵敏,检测限为5.67×10 ng/μL(2.24 f M)。此外,该方法可用于筛选MGMT抑制剂,并在单细胞水平上检测内源性MGMT活性,在临床诊断、生物医学研究和药物开发方面具有巨大潜力。