芍药种子油体发育特点及PlOLE4基因功能的初步研究
作者单位：扬州大学
学位级别：硕士
导师姓名：陶俊
授予年度：2023年
学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学]
摘 要：芍药(Paeonia lactiflora Pall.)是芍药科芍药属多年生草本植物,因具有极高的观赏价值而闻名。近年来,随着牡丹籽油被确定为新型资源食品后,作为同科属植物的芍药,其油用价值也开始得到关注。但目前油用芍药的研究尚处于起始阶段,基本集中在油用芍药的品种筛选、籽油提取和理化性质测定以及脂肪酸合成途径中相关基因挖掘等方面,而对于芍药油脂存储的分子机制研究较少。油体作为存储油脂的细胞器,积极参与脂类代谢、脂类存储等生物学功能。种子中油脂含量与种子细胞中油体相关。因此,从油体入手,解析芍药种子油脂储存的分子机制具有重要意义。本研究基于课题组前期筛选的两个含油量差异较大的‘杭芍’品系HS20(低含油量)和HS37(高含油量)的种子为材料,通过不同发育时期的种子微观切片观察、种子油体的稳定性观察以及种子中脂肪酸成分及含量的测定探究种子油体与含油量的关系;通过转录组学三代与二代测序技术,分析筛选在维持油体大小与稳定性中起十分重要作用的油体膜蛋白(OLE)基因家族,最后选择差异表达基因中表达量最高的PlOLE4进行了基因克隆与功能验证,以明确芍药PlOLE4基因在油脂存储中的作用。主要研究结果如下:(1)以‘杭芍’HS20和HS37两个品系花后30、45、60、75和90d的种子为材料,进行了种子油体发育特点研究。结果表明随着种子发育时期的变化,种子中脂类物质呈现先增加后降低的趋势,同时油体随着发育进程不断增多和扩大,高含油量的HS37中的油体体积和数量均要比其在低含油量的HS20中略有增加。NaCl浓度较高时、pH值为酸性是对芍药油体的破坏性较大,但高含油量的HS37的稳定性要优于低含油量的HS20,而温度对油体结构的影响较小。GC-MS分析发现‘杭芍’种子中存在5种主要的脂肪酸:棕榈酸、硬脂酸、α-亚麻酸、亚油酸和油酸,含量最高的是α-亚麻酸,最低的是硬脂酸;且高含油量的HS37的总脂肪酸含量及5种主要脂肪酸含量均要高于低含油量的HS20中的含量。(2)采用二代结合三代的转录组测序技术,三代测序共获得了获得了 484931条ROI序列和441185条FLNC转录本,整体组装良好。以此作为参考基因库对18个独立样本的二代转录组测序测序结果进行分析,共获得了 115.56 Gb的数据,每个clean reads的数据占原始数据的94.51%以上,通过KEGG富集通路分析发现,在L30D-VS-H30D、L60D-VS-H60D、L90D-VS-H90D3 个比较组中,参与不饱和脂肪酸生物合成的差异表达基因分别为32、20和4个;参与脂肪酸降解的差异表达基因分别为104、37、5个;参与脂肪酸延长的差异表达基因分别为25、22、1个;参与α-亚麻酸代谢的差异表达基因分别为78、33、5个;参与亚油酸代谢的差异表达基因分别为11、11、0个,参与甘油酯代谢的差异表达基因分别为77、24、3个,参与甘油磷脂代谢的差异表达基因分别为105、38、2个。同时我们鉴定到了 10个OLE基因家族成员,氨基酸数在116-220之间,分子质量在9.21-40.42 kDa之间,等电点在5.4-10.45之间,脂肪族指数、蛋白疏水性、不稳定系数以及螺旋结构等也各不相同。OLE基因家族成员均具有保守域(PF01277)每个OLE基因包含motif 6-9个,而PlOLE4包含了 10个motif。(3)基于转录组测序的结果,筛选出表达量最高且在种子发育时期表达最活跃的PlOLE4基因作为研究对象,对PlOLE4进行克隆,得到了核苷酸序列全长819 bp,开放阅读框为435 bp,共145个氨基酸,在高含油量的‘杭芍’HS37种子中的表达水平高于在其在低含油量‘杭芍’HS20中的表达;借助烟草原生质体进行了亚细胞定位观察,推测它定位于油体上。将PlOLE4在烟草中过表达后,转基因烟草种子中的总脂肪酸含量及主要脂肪酸含量均明显高于其野生型烟草种子中的含量;将PlOLE4在拟南芥突变体At2g25890中进行功能回补实验,发现回补后的拟南芥种子中的总脂肪酸含量及主要脂肪酸含量均要高于其突变体种子中的含量,且与其在野生型拟南芥种子中的含量相当,说明了 PlOLE4基因具有油脂存储的功能。
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