桑椹花青素对Aβ诱导PC12细胞损伤的保护作用及机制研究

作     者：朱晓晗 

作者单位：烟台大学 

学位级别：硕士

导师姓名：殷军港;王洪伦

授予年度：2023年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：阿尔茨海默病 桑椹花青素 自噬 AKT/mTOR 

摘      要：阿尔茨海默病(AD)是人类致死率最高的神经退行性疾病,以进行性记忆丧失和认知障碍为主要特征。大脑中Aβ沉积会造成线粒体结构及功能障碍,诱发氧化应激并激活凋亡信号通路,导致神经元细胞损伤。花青素是一种广泛存在于植物中的黄酮类化合物,在桑椹果实中含量丰富,具有广泛的生物活性。本研究利用体外培养的神经前体样大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞建立Aβ诱导的AD细胞损伤模型,评价桑椹花青素提取物(MA)和矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(C3G)、矢车菊素-3-O-芸香糖苷(C3R)两种单体化合物对细胞损伤的保护作用,并从氧化应激及细胞自噬方面探讨其作用机制。主要开展的实验方法与结果如下:方法:利用LC-MS法分析MA中的花青素成分;采用MTT法测定细胞活力,倒置显微镜观察细胞形态;采用DCFA-DA荧光探针检测细胞活性氧含量,比色法检测细胞内LDH释放率和抗氧化酶GSH含量和SOD活性,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位;采用免疫荧光分析细胞内LC3-Ⅱ含量;应用Western Blot技术检测BACE-1蛋白,线粒体裂变融合蛋白(Drp1、OPA1),细胞凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2、Caspase3家族),细胞自噬相关蛋白(Beclin-1、LC3B、p62)以及自噬信号通路蛋白AKT和mTOR的表达水平。结果:(1)MA能够升高Aβ处理后细胞活力,降低细胞内ROS及LDH的含量,增加抗氧化酶SOD和GSH活性;线粒体功能方面,MA能够升高OPA1蛋白表达量,降低Drp1的表达量;细胞凋亡方面,MA降低了Bax和Cleaved-Caspase-3蛋白表达量,增加Bcl-2蛋白表达。(2)LC-MS分析发现MA中包含的花色苷为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷,标准曲线法测定MA中两种花色苷总含量为18.6%。(3)MA及化合物C3G、C3R处理后自噬蛋白p62表达量减少,Beclin-1表达和LC3Ⅱ/Ⅰ比值增加,AKT和mTOR蛋白的磷酸化水平被抑制。结论:综上所述,本研究发现MA主要从氧化应激、线粒体功能、细胞凋亡、细胞自噬等方面来改善Aβ对PC12细胞造成的损伤。在细胞自噬方面可能通过介导AKT/mTOR信号通路来增强自噬水平。同时在化合物水平上验证发现C3G与C3R均能够促进细胞自噬发生,且C3R的保护效果优于C3G。