广西苦丁茶多糖的抑菌性及转录组分析

作     者：李亚婕 

作者单位：广西师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘灵;黄庶识;韦霄

授予年度：2023年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：苦丁茶冬青 苦丁茶冬青多糖 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA) 转录组分析 抑菌机理 

摘      要：近30年来,抗生素的不合理使用或者滥用,使得越来越多的病原菌产生耐药现象,抗生素的更新换代的速度甚至赶不上耐药菌株的更替速度,并且市面上的抗生素成本高还有一定的药源性副作用,开发新的抑菌剂刻不容缓。苦丁茶是国家卫健委明确公告的药食两用的植物,无毒且具有明显的抑菌、抗氧化、降血糖、抗炎等功效,对耐药菌有显著的抗菌活性,其中的苦丁茶多糖是其抑菌作用的主要成分。为了探究苦丁茶多糖对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA USA300)的抑制作用及其抑菌机理,本文以USA300为研究对象,通过热水浸提苦丁茶冬青(Ilex kudingcha ***)粗多糖并用醇沉、sevage法对其进行分离纯化,分别探究其对USA300的抑菌活性,通过转录组技术,分析苦丁茶冬青的多糖对耐药菌USA300的抑菌机理,推测苦丁茶冬青多糖对USA300的抑制靶点,阐明苦丁茶冬青多糖对USA300的致病力的影响。主要研究结果如下:1.苦丁茶冬青的水浸提粗提物(后简称水提物)对大肠杆菌以及耐药与不耐药的两种金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,*** atcc 6538)(MRSA USA300)(后均简称金葡菌)的最小抑制浓度分别为4.167、2.083和2.083 mg/m L。与广西武鸣、天等等地的苦丁茶冬青相比,来自广西大新县的苦丁茶冬青水提物对上述三株病原菌的抑菌圈最大,抑制效果更明显,其水提物中所含主要成分苦丁茶冬青粗多糖含量与抑菌圈的大小呈正相关。而青霉素对耐药性菌株USA300抑制作用不显著,苦丁茶冬青粗多糖明显抑制耐药性菌株USA300的生长。可见,苦丁茶冬青粗多糖具有广谱抑菌性,是苦丁茶冬青的主要抑菌活性成分。2.对苦丁茶冬青粗多糖进行进一步地分级纯化,得到3个纯化(KDPL1、KDPL2、KDPL3)组分。3个纯化组分抑菌试验结果显示,其抑菌活性均小于苦丁茶冬青粗多糖。推测可能是各纯化组分在粗多糖纯化过程中,相关蛋白质、糖醛酸和硫酸基等与抗菌性活性相关的成分流失,也可能是粗多糖几个组分间有协同抗菌作用,或者各个组分有不同的作用靶点,各组分单独作用于细菌时活性不如多个组分多个靶点作用效果好。3.通过转录组技术分析苦丁茶多糖对耐药金葡菌菌株USA300的抑制机制发现:(1)苦丁茶冬青多糖通过下调USA300的fmt C、mva S基因,抑制肽聚糖的合成,影响细胞壁的厚度以及通透性,使药物成功入侵至细胞体内,并且通过下调fmt C基因下调加速USA300细胞的溶解;(2)苦丁茶冬青多糖下调基因vra F、基因vra E以及基因sdh C,抑制USA300对自身生长代谢所必需溶质的摄取以及抑制细胞外排泵对药物的外排;(3)苦丁茶冬青多糖还通过抑制rib A、rib B、rib D、rib H等基因表达及其表达的酶活性或其产物黄素单核苷酸(FMN)含量,破坏金葡菌的核黄素稳态;通过抑制por A、por B等基因表达降低SHD(琥珀酸脱氢酶)等酶活性,进而抑制USA300的能量代谢与营养摄取。4.苦丁茶冬青多糖极大的影响了USA300的致病力:(1)苦丁茶冬青多糖通过对Clfb和Spa蛋白合成的抑制,使USA300的黏附性降低,降低其毒力;(2)苦丁茶冬青多糖还通过下调基因sae S、sae R基因表达,影响Sae RS TCS信号通路,抑制下游多个毒力因子的合成,抑制hlg A表达后的溶血功能并且降低其黏附性,进而降低USA300的致病力;(3)苦丁茶冬青多糖还通过抑制pur K、pur Q、pur L、pur F、pur M、pur H、pur D基因表达的几种合成酶活性,抑制USA300源头嘌呤的生物合成而降低对宿主的致病力;(4)苦丁茶冬青多糖处理还下调sdh C、gap B、por A、por B以及pck A等基因表达及其表达产物,几种呼吸作用及物质转化相关的酶活性,抑制USA300的糖酵解以及糖异生作用,还抑制生物膜上蛋白质合成所需氨基酸的生物合成能力,降低USA300的致病力。综上所述,苦丁茶冬青多糖通过下调USA300的fmt C和mva S基因表达减少细胞壁厚度,使药物成功渗入至菌株细胞内,加速USA300溶解;还通过抑制rib A、rib B等酶活性,抑制USA300的能量代谢与营养摄取;通过下调vra F、vra E等基因,抑制外排泵对药物的外排;还通过下调Clfb和Spa基因表达的蛋白的合成以及下调sae S和sae R等基因,使USA300的黏附性降低,降低其毒力;下调基因hlg A、pur K、gap B、gpm A、sdh C、por A等基因表达及抑制其表达的酶活性,破坏USA300核黄素稳态、抑制源头嘌呤的生物合成、糖酵解以及糖异生作用,进而降低USA300的致病力。可见,