CNP及NPRB对胃癌细胞AGS增殖、迁移影响的研究

作     者：李姗姗 

作者单位：承德医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：李春辉

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：胃癌AGS细胞 CNP NPRB NF-κB信号通路 

摘      要：胃癌是一种严重威胁人类生命健康的消化道恶性肿瘤,其发病率、死亡率在恶性肿瘤中均排在第三位。由于早期胃癌缺乏特异性症状,大多数患者确诊时已处于进展期,治疗效果不佳,5年生存率低,预后差。因此,深入了解胃癌的发生发展机制并找寻新的靶向药物显得至关重要。C型钠尿肽(C-type natriuretic peptide,CNP)是钠尿肽家族的一员,其在心血管方面的研究较多。NPRB是其特异性受体,两者结合后催化产生c GMP进而激活PKG,从而发挥生物学效应。CNP能够显著抑制小细胞肺癌癌细胞的增殖,而且在前列腺癌中CNP可作为潜在标志物。但CNP在胃癌中是否有相似作用尚未见报道,其作用机制有待研究。NF-κB信号通路是一种经典信号通路,与癌症的发生发展息息相关。NF-κB信号通路的异常激活能够促进胃癌的发生发展,影响胃癌的癌细胞增殖、凋亡、转移与浸润等。NF-κB p65是NF-κB信号通路的关键蛋白,其磷酸化能够激活NF-κB信号通路,促进胃癌的发生发展。在前列腺癌中,CNP可以抑制LPS诱导的NF-κB p65的磷酸化和NF-κB信号通路的激活,进而影响肿瘤的发生发展。但CNP、NPRB及NF-κB信号通路三者对胃癌细胞的影响尚未见报道。本实验拟以胃癌细胞AGS为研究对象,探讨CNP、NPRB以及NF-κB信号通路对胃癌细胞增殖及迁移的影响,旨在深入认识胃癌的发生发展机制,为胃癌的临床治疗寻找新的抑制剂及潜在药物作用靶点。本实验分为三部分:第一部分CNP对胃癌细胞AGS增殖、迁移的影响目的:研究CNP对胃癌细胞AGS增殖和迁移的影响。方法:1.采用CCK-8实验检测不同浓度CNP(0μmol/L、0.1μmol/L、1μmol/L、10μmol/L)处理胃癌细胞AGS 24 h和48 h后对细胞增殖能力的影响。2.采用划痕实验检测10μmol/L CNP处理胃癌细胞AGS 24 h后对细胞迁移能力的影响。3.实验分组:Blank组、CNP组。结果:***-8结果显示,CNP处理后,胃癌细胞AGS的增殖抑制率达(44.72%±2.56%),细胞增殖能力减弱(P0.05),且在处理浓度为10μmol/L时呈时间-剂量依赖性。2.划痕实验结果显示,CNP处理后,胃癌细胞AGS的划痕面积愈合率(7.95%±1.77%)较空白组(38.60%±3.26%)明显降低,细胞迁移能力减弱(P0.05)。小结:CNP可抑制胃癌细胞AGS的增殖和迁移。第二部分NPRB基因沉默对胃癌细胞AGS增殖、迁移的影响目的:研究NPRB基因沉默对胃癌细胞AGS增殖和迁移的影响。方法:1.利用RFect小核酸转染试剂将si-NPRB及si-NC分别转入胃癌细胞AGS。2.采用q RT-PCR和Western Blotting实验检测NPRB基因沉默效率。3.采用CCK-8和划痕实验检测NPRB基因沉默对胃癌细胞AGS增殖、迁移的影响。4.实验分组:Blank组、si-NC组、si-NPRB组。结果:1.q RT-PCR及Western Blotting实验结果显示,转染后NPRB m RNA相对表达量(0.445±0.038)及NPRB蛋白的相对表达量(0.600±0.025)下降,基因沉默效果明显(P0.05),且si-RNA3组表达量最低,选择其进行后续实验。***-8实验结果显示,NPRB基因沉默24 h后胃癌细胞AGS的细胞抑制率(16.74%±1.00%)高于沉默48 h的细胞抑制率(3.43%±3.71%),细胞增殖能力减弱,且转染24 h作用较强(P0.05)。3.划痕实验结果显示,NPRB基因沉默24 h后胃癌细胞AGS的划痕面积愈合率(13.85%±0.79%)低于阴性对照组的愈合率(39.35%±0.41%),细胞迁移能力明显减弱(P0.05)。小结:NPRB基因沉默可抑制胃癌细胞AGS的增殖和迁移。第三部分CNP抑制胃癌细胞AGS增殖和迁移与NPRB、NF-κB信号通路的关系目的:依据第一二部分的实验结果,进一步研究CNP抑制胃癌细胞AGS增殖和迁移与NPRB、NF-κB信号通路之间的关系。方法:1.采用CCK-8实验检测NPRB基因沉默后加CNP处理胃癌细胞AGS 48 h对细胞增殖能力的影响。2.采用划痕实验检测NPRB基因沉默后加CNP处理胃癌细胞AGS24 h对细胞迁移能力的影响。3.采用Western Blotting实验检测CNP处理前后胃癌细胞AGS中NPRB、P65及p-P65的蛋白相对表达量。***-8及划痕实验分组:Blank组、si-NC组、si-NPRB组、CNP组及si-NPRB+CNP组;Western Blotting实验分组:Blank组、CNP1(1μmonl/L)组、CNP2(2.5