铅暴露通过NFκB p65/RBBP4/Survivin信号通路诱导神经元凋亡的研究

作     者：陈惠 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：祝高春

授予年度：2023年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：铅暴露 细胞凋亡 NFκB p65 RBBP4 Survivin 

摘      要：重金属铅(Lead,Pb)可以通过饮水、电子污染、化工品等多种途径接触人体,对人类多个器官均有危害。其中,铅暴露对神经系统危害尤为明显,能造成个体神经系统发育迟缓以及认知功能障碍。细胞凋亡是为维持内环境稳定,由基因调控的细胞自主性的死亡过程,对于保证神经系统正常发育有重要作用。RB结合蛋白4(RB binding protein 4,RBBP4)是与核心组蛋白结合的亚基之一,可以调控DNA复制和DNA修复过程,与神经系统细胞的凋亡进程密切相关。但在铅暴露环境中,RBBP4是否能够调控神经元凋亡尚不可知。此外,RBBP4表达可能受到核因子κB p65(nuclear factor kappa B,NFκB p65)调控。但在铅暴露环境中,是否存在此调控机制尚不明确。实验目的:首先,本实验建立了PC12细胞和SD大鼠铅暴露模型,研究铅暴露对神经元凋亡的影响。其次,在铅暴露条件下观察RBBP4表达变化情况,探究其与神经元凋亡之间的关系。最后,在铅暴露条件下,观察NFκB p65的表达变化情况,探究NFκB p65与RBBP4之间的关系。本课题为铅暴露引起的神经系统功能障碍提出了新的分子机制,为铅中毒的治疗提供了新的靶点。实验方法:1、铅暴露对PC12细胞和SD大鼠海马组织凋亡的影响:取性成熟SD大鼠,按照雌性:雄性=2:1比例进行合笼。将受精的雌性大鼠随机分为空白对照组(CON)、低浓度铅暴露组(LLG)和高浓度铅暴露组(HLG)。使用含醋酸铅浓度为0、0.5、2.0g/L的饮用水进行SD大鼠铅暴露模型的建立。PC12细胞传代后添加含铅浓度为0μM、1μM、100μM的培养基,24小时后完成细胞铅暴露模型的建立。通过逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcriptase polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白印迹技术(Western blotting,WB)测定SD大鼠海马组织和PC12细胞中凋亡抑制蛋白Survivin的表达水平,使用原位末端转移酶标记法(Td T-mediated d UTP nick end labeling,TUNEL)测定SD大鼠海马组织和PC12细胞中的凋亡水平。2、在铅暴露环境下,RBBP4表达变化情况以及RBBP4对神经元凋亡的影响:建立SD大鼠和PC12细胞铅暴露模型,使用RT-PCR、WB以及免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)观察RBBP4的m RNA和蛋白表达变化情况。在铅暴露条件下建立RBBP4过表达模型,将细胞随机分为10μM Pb+pc DNA3.1组和10μM Pb+pc DNA3.1-RBBP4组,观察RBBP4和Survivin的m RNA和蛋白表达变化情况,使用细胞增殖及毒性检测试剂盒(Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit 8,CK8)测定PC12细胞活力,使用TUNEL测定PC12细胞凋亡情况。3、在SD大鼠和PC12细胞铅暴露模型中NFκB p65表达情况:建立SD大鼠和PC12细胞铅暴露模型,使用RT-PCR、WB以及IHC观察NFκB p65 m RNA和蛋白表达变化情况。4、在PC12细胞铅暴露模型中,添加吡咯烷二硫代甲酸铵盐(Pyrrolidinedithiocarbamate ammonium,PDTC)抑制NFκB p65活性,观察RBBP4表达情况:使用磷酸缓冲盐溶液(Phosphate buffer saline,PBS)溶解PDTC抑制PC12细胞中NFκB p65的活性。将细胞随机分为三组,对照组(0μM Pb+100μM PBS)、铅暴露组(10μM Pb+100μM PBS)、抑制剂组(10μM Pb+100μM PDTC)。使用RT-PCR、WB以及IHC观察NFκB p65和RBBP4的m RNA和蛋白表达变化情况。实验结果:1、铅暴露引起SD大鼠海马组织和PC12细胞发生凋亡:TUNEL实验结果发现,随着铅浓度上升,SD大鼠海马组织DG区、CA1区及CA3区神经元凋亡增加;在PC12细胞铅暴露模型中发现,细胞凋亡随着培养基中铅浓度上升而增加。CCK8结果显示,PC12细胞的活性随培养基中铅浓度上升而下降(P0.05)。此外,我们还发现,凋亡抑制蛋白Survivin的m RNA和蛋白水平随着铅浓度上升而下降(P0.05)。2、铅暴露引起SD大鼠海马组织和PC12细胞中RBBP4表达发生变化:RT-PCR结果显示,在大鼠海马组织和PC12细胞中,随着铅浓度的上升,RBBP4的m RNA表达下降(P0.05)。WB结果显示,在大鼠海马组织和PC12细胞中,随着铅浓度的上升,RBBP4的蛋白表达下降(P0.05)。IHC结果显示,随着铅浓度的上升,RBBP4在PC12细胞和海马组织DG区、CA1区及CA3区的蛋白表达下降(P0.05)。3、铅暴露环境下过表达RBBP4,可以增加Survivin表达,挽救神经元凋亡:RT-PCR结果显示,相较于10μM Pb+pc DNA3.1组,10μM Pb+pc DNA3.1-RBBP4组中RBBP4以及Survivin的m RNA表达上升(P0.05)。WB结果显示,相较于10μM Pb+pc DNA3.1组,10μM Pb+pc DNA3.1-RBBP4组中RBBP4以及Survivin的蛋白表达上升(P0.05)。CCK8结果显示,相较于10μM Pb+pc DNA3.1组,10μM Pb+pc DNA3.1-RBBP4组中细胞活性明显上升(P0.05)。TUNEL结果显示,相较于10μM Pb+pc DNA3.1组,10μM Pb+pc DNA3.1-RBBP4组中发生凋亡的细胞明显减少。4、铅暴露引起SD大鼠海马组织和PC12细胞中NFκB p65表达发生变化:RT-PCR结果显示,在大鼠海马组织和PC12细胞中,NFκB p65的m RNA表达上升(P0.05)。WB结果显示,在大鼠海马组织和PC12细胞中,随着铅浓度的上升,NFκB p65的蛋白表达上升(P0.05)。IHC结果显示,随着铅浓度的上升,NFκB p65在PC12细胞和海马组织DG区、CA1区及CA3区的蛋白表达上升(P0.05)。5、铅暴露条件下,抑制PC12细胞中NFκB p65活性可以增加RBBP4表达:WB结果显示,相较于对照组,铅暴露组中RBBP4的蛋白表达下降,NFκB p65的蛋白表达上升;而相较于铅暴露组,抑制剂组中RBBP4的蛋白表达上升,NFκB p65的蛋白表达下降(P0.05)。RT-PCR结果显示,相较于对照组,铅暴露组中RBBP4的m RNA表达下降;而相较于铅暴露组,抑制剂组中RBBP4的m RNA表达上升(P0.05)。IHC结果显示,相较于对照组,铅暴露组中RBBP4的蛋白表达下降,NFκB p65的蛋白表达上升;而相较于铅暴露组,抑制剂组中RBBP4的蛋白表达上升,NFκB p65的蛋白表达下降(P0.05)。结论:铅暴露通过上调NFκB p65的表达水平抑制RBBP4表达,导致Survivin表达下降,从而引起神经元凋亡,损害学习记忆。这为进一步阐明铅对学习记忆影响中的分子机制,为治疗慢性铅暴露导致的神经毒性提供新的思路和方法。