ERS通过Cx43半通道介导的P2X7受体激活参与内皮细胞炎症损伤的作用及其机制研究

作     者：刘紫琴 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：蒋丽萍

授予年度：2023年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：ERS Cx43半通道 P2X7受体 HUVECs炎症损伤 

摘      要：目的:动脉粥样硬化是众多心血管疾病的发病基础。近年来发现内皮细胞炎症损伤是诱发动脉粥样硬化的重要因素。研究表明内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)与细胞炎症损伤相关,但其机制尚未被完全阐明。而缝隙连接蛋白43(Connexin 43,Cx43)半通道参与了内皮损伤过程,同时P2X7受体作为各种炎症性疾病的潜在靶点被广泛研究。因此,本研究旨在探讨ERS、Cx43半通道和P2X7受体在内皮细胞炎症损伤中的作用及调控机制。方法:采用800μmol/L的HO刺激HUVECs 4 h构建内皮细胞炎症损伤模型;用500μmol/L浓度的TUDCA处理HUVECs 1 h抑制ERS;100μmol/L浓度的Gap19处理HUVECs 24 h抑制Cx43半通道的活性;20μmol/L浓度的A-740003处理HUVECs 1 h抑制P2X7受体的表达;100μmol/L的CT9处理HUVECs 24 h激活Cx43半通道的活性。按照上述处理进行相应的分组,检测方法和指标如下:采用倒置荧光显微镜观察单核-内皮黏附情况;NO检测试剂盒检测NO释放水平;Western blot检测内皮细胞炎症损伤相关蛋白(ICAM-1、VCAM-1、NLRP3和Cleaved-caspase-1)、ERS标志蛋白(GRP78、IRE1α和XBP1)、Cx43蛋白和P2X7受体的表达水平;EB染料摄取实验评估Cx43半通道的活性;ATP检测试剂盒检测ATP的释放情况;免疫荧光实验观察NLRP3炎性小体的形成情况。结果:***刺激HUVECs,结果显示:单核-内皮黏附增加;NO释放减少;炎症损伤相关蛋白ICAM-1、VCAM-1、NLRP3和Cleaved-caspase-1表达增加;NLRP3炎性小体形成增多。提示模型构建成功。2.探究ERS在HO诱导的内皮细胞炎症损伤中的作用。HO处理HUVECs后ERS标志蛋白GRP78、IRE1α和XBP1的表达均上升;HUVECs先后用TUDCA和HO处理,结果发现:TUDCA能抑制HO引起的ERS标志蛋白表达的增加、单核-内皮黏附增加、NO释放减少、炎症损伤相关蛋白表达增加和NLRP3炎性小体形成增多。表明ERS参与了内皮细胞炎症损伤的过程,抑制ERS可以减轻内皮细胞炎症损伤。3.验证ERS调控Cx43半通道活性。模型中内皮细胞Cx43蛋白表达上调、Cx43半通道活性增加且释放到细胞外的ATP增多;TUDCA抑制ERS后使Cx43蛋白表达下调、Cx43半通道的活性下降且ATP的释放减少。提示Cx43半通道与内皮细胞炎症损伤密切相关,抑制ERS使Cx43半通道活性降低。4.探究Cx43半通道在HO诱导的内皮细胞炎症损伤中的作用。HUVECs用Gap19预处理再用HO刺激,结果表明:与HO组相比,Gap19+HO组Cx43半通道活性降低、单核-内皮黏附减少、NO释放增加、炎症损伤相关蛋白表达下降和NLRP3炎性小体形成减少。表明抑制Cx43半通道活性减轻内皮细胞炎症损伤。5.验证ERS调控Cx43半通道活性并进一步影响P2X7受体的表达。HO处理HUVECs后P2X7受体表达上调;TUDCA抑制ERS使P2X7受体下调。Gap19抑制Cx43半通道活性后ATP释放减少且P2X7受体下调。提示抑制ERS和抑制Cx43半通道活性均下调P2X7受体的表达。6.探究P2X7受体在HO诱导的内皮细胞炎症损伤中的作用。HUVECs先后用A-740003和HO处理,结果显示:与DMSO+HO组相比,A-740003+HO组P2X7受体表达下降、单核-内皮黏附减少、NO释放增加、炎症损伤相关蛋白表达下降和NLRP3炎性小体形成减少。表明抑制P2X7受体减轻内皮细胞炎症损伤。7.确证ERS通过Cx43半通道激活P2X7受体导致内皮细胞炎症损伤。HUVECs先后用TUDCA、CT9和HO处理,P2X7受体表达上调;单核-内皮黏附增加、NO释放明显减少、炎症损伤相关蛋白表达升高和NLRP3炎性小体形成增加。提示激活Cx43半通道能逆转抑制ERS对内皮细胞炎症损伤的作用。结论:***参与HO诱导的内皮细胞炎症损伤。***可能通过Cx43半通道激活P2X7受体导致内皮细胞炎症损伤。