低压缺氧状态下线粒体UCP4保护小脑浦肯野细胞的作用机制

作     者：王瑞青 

作者单位：延安大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王亚云;王璐

授予年度：2023年

学科分类：07[理学] 0713[理学-生态学] 

主      题：低压缺氧 UCP4 线粒体 小脑浦肯野细胞 

摘      要：目的:高原地区是我国经济发展和国防建设的重要区域,随着社会发展进步,高原地区的活动人数逐渐增加,但其低压缺氧的环境特征使人在高原的脑体作业能力和劳动效率明显下降,严重影响了人们在高原地区的活动能力,经济建设和军事行动。目前缺乏新的提高高原脑体作业能力的技术手段。本研究旨在探讨低压缺氧状态下小脑浦肯野细胞线粒体UCP4与运动的关系,有望对提高我军高原军事作业能力和医学研究发展方向有所启示,并且很可能为人类在低压缺氧环境下运动性能的提高提供策略。方法:(1)使用Cre-Loxp技术构建小脑浦肯野细胞中Ucp4特异性敲除小鼠,即Pcp2-Cre::Ucp4小鼠,通过鼠尾PCR鉴定小鼠基因型,并通过Western blot、q PCR与RNAscope确定小脑浦肯野细胞中UCP4的分子学变化。通过旷场实验、高架十字迷宫实验以及转棒实验,评估Pcp2-Cre::Ucp4小鼠运动能力变化。(2)构建高原海拔5000 m低压缺氧模型,小鼠在低压氧舱中连续生活五天,每天进行16 h,之后通过q PCR、免疫荧光染色与RNAscope等技术检测小脑皮质Ucp4、Ucp2、Ucp5、Drp1、Fis1、Mff、Mfn1、Mfn2、Opa1和Tfam等分子变化;通过旷场实验、高架十字迷宫实验以及转棒行为学实验,评估Pcp2-Cre::Ucp4小鼠低压缺氧前后运动能力的变化;通过电镜观察Pcp2-Cre::Ucp4小鼠小脑浦肯野细胞低压缺氧前后线粒体形态变化。(3)构建UCP4过表达病毒:p AAV-CMV-MTS-UCP4-EGFP-3x FLAG-WPRE,在正常小鼠小脑立体定位注射,过表达小脑皮质中UCP4蛋白,通过旷场实验、高架十字迷宫实验以及转棒行为学实验,评估过表达UCP4后,小鼠低压缺氧前后运动能力变化。结果:鼠尾鉴定实验结果显示:(1)成功构建小脑浦肯野细胞Ucp4特异性敲除小鼠:Pcp2-Cre::Ucp4小鼠;q PCR、Western blot与RNAscope实验结果显示浦肯野细胞UCP4蛋白和Ucp4 m RNA含量降低;旷场实验结果显示Pcp2-Cre::Ucp4小鼠运动能力出现下降,高架十字实验和转棒实验结果显示小鼠情绪、协调性与耐力无明显变化。(2)与对照组Ucp4小鼠相比,旷场实验结果显示Pcp2-Cre::Ucp4小鼠模拟低压缺氧后运动能力降低更为明显;q PCR、免疫荧光与RNAscope实验结果显示模拟低压缺氧后,两组小鼠小脑皮质UCP4和UCP5升高、UCP2下降;q PCR结果显示,模拟低压缺氧后,两组小鼠小脑皮质线粒体分裂相关基因Drp1和Fis1表达均升高;Ucp4小鼠小脑皮质Mff和Tfam表达升高,Pcp2-Cre::Ucp4小鼠小脑皮质Mfn1表达升高。电镜结果显示小鼠低压缺氧后,小脑浦肯野细胞胞体内的单位面积下线粒体的所占面积显著增大,单位面积线粒体的个数显著增多。(3)旷场实验、高架十字实验和转棒实验结果显示在正常小鼠小脑皮质过表达UCP4后低压缺氧未对小鼠运动、情绪、耐力和运动协调性产生影响。结论:低压缺氧状态下敲除小脑浦肯野细胞中的Ucp4基因,可以减弱小鼠运动能力,可能是通过影响线粒体的生物合成等功能发挥作用。