TMEPAI与Nedd4协同调控NF-κB信号途径机制与功能研究

作     者：张亚新 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刁爱坡

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：TMEPAI Nedd4 IκBα NF-κB信号途径 

摘      要：NF-κB信号在多种癌症中异常激活,并且通过调控细胞增殖,细胞侵袭和炎症反应等相关基因的表达参与肿瘤的发生发展。前列腺跨膜蛋白TMEPAI在多种肿瘤组织中高表达,与肿瘤的发生发展密切相关。前期探究发现TMEPAI能够与IκBα在体外相互作用,另有研究报道TMEPAI能够与E3泛素连接酶Nedd4相互作用。本论文将进一步解析TMEPAI促进肿瘤发生发展的机制,深入研究TMEPAI、Nedd4与IκBα相互作用以及三者协同调控NF-κB信号的作用与功能。通过CRISPR-Cas9技术成功构建敲除TMEPAI,Nedd4的He La细胞系。采用免疫共沉淀证明TMEPAI,Nedd4和IκBα三者在细胞中存在相互作用,可以形成三元复合体;并且TMEPAI作为衔接蛋白介导Nedd4与IκBα在体内相互作用。采用体内泛素化实验证明敲除TMEPAI、Nedd4抑制IκBα的泛素化,同时过表达TMEPAI与Nedd4能够协同增强IκBα的泛素化,而表达TMEPAI-2YA突变体则不能,说明TMEPAI与Nedd4协同促进IκBα泛素化降解依赖于TMEPAI与Nedd4的相互作用。通过荧光素酶报告基因实验、Western blot和免疫荧光技术以及q RT-PCR实验探究TMEPAI与Nedd4对NF-κB信号的协同激活作用,实验证明TMEPAI与Nedd4能够协同促进NF-κB信号报告基因p NF-κB-Luc活性、p65核易位以及NF-κB下游靶基因(包括Cyclin D1、c-Myc、ICAM-1、MMP9、i NOS、COX-2、TNF-α)的表达。通过MTT以及Ki-67实验证明TMEPAI和Nedd4能够协同增强He La细胞活力,促进细胞增殖,并且TMEPAI和Nedd4的促细胞生长活性依赖于NF-κB信号的激活。体内裸鼠荷瘤实验发现敲除TMEPAI、Nedd4能够抑制荷瘤裸鼠肿瘤的生长,其中对照组的平均肿瘤重量为0.49g,而敲除TMEPAI、Nedd4组的平均肿瘤重量仅为0.07g、0.18g。并且在肿瘤组织中敲除TMEPAI、Nedd4也能够抑制IκBα的降解。综上所述,TMEPAI、Nedd4和IκBα在细胞内可以形成三元复合物,TMEPAI通过募集Nedd4泛素化降解IκBα,促进p65入核,激活NF-κB信号,促进NF-κB下游靶基因的表达,进而促进肿瘤的发生发展。本论文研究揭示了TMEPAI通过激活NF-κB信号促进肿瘤发生发展的新机制,为以TMEPAI为靶点治疗肿瘤奠定了理论基础。