陆地棉DMPs基因的克隆及功能初步研究

作     者：王欣瑜 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张永山

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0901[农学-作物学] 

主      题：基因编辑 DMP 功能验证 转基因 

摘      要：DMP(DOMAIN OF UNKNOWN FUNCTION 679 membrane protein)是一种植物特异性膜蛋白,参与植物的程序性细胞死亡过程,影响植物双受精过程中的生殖发育。而棉花中DMP基因的鉴定和相关功能研究鲜少报道。因此,本研究利用生物信息学方法在棉花全基因组中进行DMP家族成员鉴定及特征分析,利用转录组数据(RNA-seq)和q RT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction)对其表达模式进行验证,并基于其进化关系及表达模式来选择相关功能基因,利用烟草亚细胞定位实验和基因编辑技术对其功能进行初步分析验证。本研究结果如下:(1)共鉴定和分析了4个棉花物种中共58个DMPs基因。系统发育分析表明,这些DMPs可分为五个亚家族(I-V)。同一亚家族中的DMPs成员通常拥有共同的保守基序,这或许暗示着它们的在功能上是相似的。共鉴定出137个重复的棉花基因对,大多数重复事件是通过全基因组重复(WGD)/片段重复形成的。含有不同顺式元件的Gh DMPs启动子区域对非生物胁迫也表现出不同的反应。此外,基因互作网络表明,DMPs作为一种内膜系统,参与了植物衰老过程和花的生殖发育。(2)对DMPs基因进行表达模式分析,大多数棉花DMP基因主要在生殖器官(萼片、花瓣、雌蕊和花药)中表达,表明这些DMP基因可能影响棉花的生殖发育过程;特别是DMP8-A/-D可作为棉花未来单倍体育种的候选基因;部分DMP基因在纤维发育后期20 DPA(Days Post Anthesis)和25 DPA中优势表达,表明这些DMP基因可能调控棉花纤维的生长发育,在棉纤维生长发育过程中发挥重要作用。(3)亚细胞定位结果表明Gh DMP2-D和Gh DMP1b-D定位于细胞质膜。(4)利用基因编辑技术构建了6个编辑载体,对11个Gh DMP基因进行敲除,对获得的T0代棉花dmp突变体进行了表型观察。发现其与对照相比,在生殖器官中花、花粉、种子等展现出显著的差异,特别是种子的结实率显著下降,表明棉花dmp功能缺失导致其育性降低。另外,通过对T0代植株初步的观察,结合进化关系和表达数据等,推测棉花Gh DMP8-A/-D可以作为诱导棉花单倍体的候选基因。因此,本研究利用生物信息学的手段和方法对棉花中的DMPs基因家族进行了鉴定及特征分析,并对其中部分DMPs基因的功能进行了初步的分析,为未来进一步对棉花DMP基因的功能验证提供了棉花突变体材料。