L-高丝氨酸发酵工艺的研究

作     者：曾茂 

作者单位：成都大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王欣荣

授予年度：2023年

学科分类：090403[农学-农药学(可授农学、理学学位）] 081703[工学-生物化工] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 09[农学] 0904[农学-植物保护] 

主      题：L-高丝氨酸 柱前衍生化 发酵优化 

摘      要：L-高丝氨酸(L-homoserine,2-amino-4-hydroxybutyric acid)是一种非蛋白原性4碳氨基酸,含有一个手性碳,是生物合成中的一个重要中间体。目前,在农业生产中主要使用化学合成农药,但其带来了害虫抗药性不断增强以及环境污染严重的问题。因此,需要在农业生产中推广和使用“绿色、无污染、健康的新型生物农药。L-高丝氨酸是合成生物农药L-草铵膦的关键中间体。L-高丝氨酸的生产方法主要分为:化学合成法、酶法和微生物发酵法。化学合成法因试剂昂贵,合成效率低,提纯步骤繁琐等缺点限制了其生产规模和应用范围。酶法需要用到昂贵的辅酶及有毒的化学试剂,限制了其工业化生产。通过微生物发酵法生产L-高丝氨酸具有低成本,低污染,条件温和易控等优点。本研究首先建立了一种检测发酵液中L-高丝氨酸的方法,然后以大肠杆菌E.coli SIIA-2021作为出发菌株,通过自然分离、发酵条件优化、发酵培养基成分优化及发酵罐补料方式优化来提高L-高丝氨酸产量。本研究主要研究结果如下:1.L-高丝氨酸经2,4-二硝基氟苯柱前衍生化后采用HPLC法进行定量分析。使用安捷伦1260HPLC高效液相色谱仪和Target-phenyl(II)色谱柱,流动相A为水:乙腈:磷酸=95:5:0.01;流动相B为水:乙腈:磷酸=25:75:0.01;检测波长:365 nm;柱温:35.0℃;流速:1.2 m L/min;进样体积:5.0μL,进样检测。L-高丝氨酸浓度在50～350μg/m L范围内线性关系良好,线性回归方程为:Y=7.8662X+31.779(R=0.9995)。精密度RSD值为0.12%,重复性RSD值为1.39%,平均加样回收率为100.28%。2.对菌株E.coli SIIA-2021进行自然分离,得到一株L-高丝氨酸产量较高的菌株,产量为3165.35μg/m L,命名为E.coli SIIA-2021-13。以该菌株作为出发菌株,对其发酵条件以及发酵培养基成分进行优化,初步确定发酵条件为:发酵时间48.0 h,发酵温度29.0℃,摇床转速220 rpm,初始p H值7.5,接种量2.0%,种子液OD值0.6～0.8。初步确定了发酵培养基成分(g/L):葡萄糖26.05,酵母浸粉1.2,亮氨酸4.8,Mg SO·7HO1.0,KHPO1.0,(NH)SO14.0,L-赖氨酸0.2,L-苏氨酸0.2,Ca CO10.0,微量元素母液5.0 m L/L。菌株E.coli SIIA-2021-13发酵条件优化后,L-高丝氨酸产量达到7759.47μg/m L,提高了145.14%。3.在50 L发酵罐上对菌株E.coli SIIA-2021-13进行小试工艺研究,确定了最佳补料培养基的补加方式。发酵罐装液量为27 L,浓氨水调节p H,控制p H值在6.9～7.1之间;当发酵时间为12 h、20 h、28 h时,补加L-赖氨酸和L-苏氨酸,使其浓度为1.0 g/L、1.5g/L、2.0 g/L;发酵过程中控制溶氧(DO)在30%左右,转速初始为300 rpm,后续调整为转速偶联溶氧,通气量约2.0 vvm;罐压24 h前设置为0.07 MPa,24 h后调整为0.09MPa～0.1 MPa;当葡萄糖耗尽后,开始补糖,葡萄糖浓度始终保持在5.0 g/L以下。当发酵时间为30 h、34 h、38 h补加补料培养基,L-高丝氨酸产量最高,为55932μg/m L。