PVA涂层玻璃纤维三维细胞培养支架的制备及应用评价

作     者：杨云澜 

作者单位：重庆大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张兵兵

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0836[工学-生物工程] 

主      题：三维细胞培养 玻璃纤维 聚乙烯醇 多孔支架 细胞工厂 

摘      要：体外细胞培养技术中,细胞三维(Three-dimensional,3D)培养相比于传统二维(Two-dimensional,2D)培养客观上能减少体外细胞模型与体内细胞间的差异。同时细胞3D培养作为科研模型能够提供更有价值的科研数据,作为组织工程和器官制造的基础具有重要的医学价值。通过3D细胞培养实现高密度培养、提高生产效率也具有工业应用前景。目前,已有多种3D培养试剂耗材商品化,也有众多实验室针对所培养的细胞开发个性化的3D培养技术,但通用性差、成本高、操作繁琐、后续分析困难等缺陷限制了3D培养技术的广泛使用。本研究以玻璃纤维为刚性支架材料,通过聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA)涂覆浸润,制备一种价格低廉、通用性好的3D培养材料,并对其进行性能表征、生物学评价和工程细胞培养实验,进而评价该培养技术的可行性和实用性。本论文主要研究内容和结论如下:(1)通过玻璃纤维和PVA纤维的酸/碱侵蚀实验、透光性实验和三种型号PVA的Zeta电位检测、细胞评价实验筛选出合适的刚性组织和浸润剂。结果显示玻璃纤维的抗侵蚀能力、透光性优于PVA纤维,PVA 205的细胞相容性较好且带正电荷。因此本研究选择玻璃纤维作为骨架材料,PVA 205作为浸润剂,制备了1%到10%PVA涂层玻璃纤维(PVA coated glass fiber,PVA-GF)支架。(2)通过检测支架的成型能力、电镜表观形貌、热重以及孔隙率、溶胀率、质量损失等评价不同浓度的PVA-GF支架理化性能。结果表明4%和5%PVA-GF支架具备良好的热稳定性、孔隙结构、吸水溶胀性和不可降解性,适用于细胞长期生长。继续利用4%、5%PVA-GF支架进行细胞培养发现,相较于2D培养,5%PVAGF支架能显著促进细胞增殖,因此选择5%的PVA-GF支架开展进一步研究。(3)对生长在PVA-GF支架内的细胞进行免疫荧光染色观察细胞生长形态,并通过转录组学对2D平面、Matrigel、PVA-GF支架三种细胞培养方式得到的人肝癌细胞(Human hepatoellular carcinomas,Hep G2)进行差异基因表达分析,从而对PVAGF支架培养环境下的细胞状态进行评价。结果显示支架为细胞提供了附着位点使得细胞沿着纤维骨架进行增殖,生长在PVA-GF支架上的细胞属于3D生长模式;在转录组学差异基因分析中发现,相较于2D培养,PVA-GF支架培养的Hep G2转录组更接近Matrigel 3D培养,推测PVA-GF支架培养的细胞状态介于2D培养和Matrigel 3D培养之间。(4)以PVA-GF支架作为填充材料,填充床式培养工程细胞,通过病毒扩增和重组蛋白表达分析该培养方式应用于生物制品生产的可能性。结果显示,生长在PVA-GF支架上的人胚肾上皮293T细胞能够被腺病毒(Adenovirus,Ad)感染,并实现扩增;中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary cells,CHO-K1)能增殖生长并分泌表达重组蛋白鸢尾素(Irisin)。相较于同等面积的2D培养,PVA-GF支架收获的病毒量提高了1.57倍,重组蛋白的表达量提高了1.49倍。综上所述,5%浓度的PVA 205涂层玻璃纤维支架具备适合细胞生长的理化性能,细胞能够在纤维网络中3D生长。Hep G2转录组学分析显示采用该方法培养的细胞基因表达更接近Matrigel培养模式,病毒扩增和重组蛋白表达实验显示该支架有工业应用的潜在价值。本研究制备的PVA-GF支架所用材料易得、价格低廉、易消毒、易存储,且细胞培养操作简便,可直接胰酶消化获得细胞用于进一步分析,有望成为一种简便易行的3D培养细胞技术,促进3D培养更广泛的应用。