NF-κB-P65对UGT1A1基因表达的影响研究

作     者：蒙翠兰 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：钟丹妮

授予年度：2021年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 0711[理学-系统科学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 08[工学] 100202[医学-儿科学] 10[医学] 

主      题：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1 苯巴比妥 NF-κB 人肝正常细胞 

摘      要：目的:探讨NF-κB-P65在人正常肝细胞(HL-7702)中对苯巴比妥体外诱导UGT1A1基因表达的影响。方法:本研究的实验对象为人正常肝细胞(HL-7702)。1.常规复苏和培养人正常肝细胞,细胞种板后使用CCK-8方法检测不同通路抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidinedithiocarbamic acid,ammonium salt,PDTC)浓度(5、10、20、50 umol/L)预处理细胞1小时后对细胞存活率的影响。根据CCK-8实验检测结果,结合相关文献及预实验中不同浓度PDTC的抑制效果;选用本研究中最佳抑制浓度的PDTC 10 umol/L抑制NF-κB通路。根据本课题组前期苯巴比妥的CCK-8实验结果,在本次研究课题中继续选择的苯巴比妥最佳药物浓度为2 mmol/L。2.将人正常肝细胞分别随机分为对照组、PDTC组、PB组以及PB+PDTC组。对照组用1640培养基培养;PDTC组使用10 mmol/L PDTC预处理1小时随后使用1640培养基培养24小时;PB组用含2 mmol/L苯巴比妥的1640培养基处理24小时;PB+PDTC组用10 mmol/L PDTC预处理1小时随后用含2 mmol/L苯巴比妥的1640培养基培养24小时。3.常规复苏和培养人正常肝细胞并分为对照组和PB组。随之,上述分组细胞目的基因(UGT1A1、NF-κB-P65)的mRNA表达水平检测采用常规的RT-q PCR;分组细胞目的基因的蛋白表达检验采取Western blotting方法进行检测。4.将人正常肝细胞复苏和培养后分为对照组、PDTC组,PB组,PB+PDTC组;随后采用RT-q PCR、Western blotting各自检验上述分组细胞中UGT1A1的mRNA及其蛋白水平的表达差异。结果:(1)苯巴比妥对HL-7702细胞UGT1A1基因及NF-κB-P65的mRNA表达水平的影响RT-q PCR实验结果显示,HL-7702细胞经与苯巴比妥孵育24小时后,与对照组相比,苯巴比妥组中的UGT1A1 mRNA的表达(1.3±0.46)较对照组(0.45±0.076)明显增加(P0.05),约为对照组表达量的2.86倍。同时,苯巴比妥组中的NF-κB-P65 mRNA的表达量(0.80±0.53)较对照组(0.34±0.12)明显增加(P0.05),约为对照组表达量的2.37倍。(2)苯巴比妥对HL-7702细胞UGT1A1基因及NF-κB P65的蛋白水平的影响Western blotting实验结果显示,HL-7702细胞经与苯巴比妥孵育24小时后,与对照组相比,苯巴比妥组中的UGT1A1的蛋白表达(1.16±0.08)与对照组(0.96±0.11)相对比,苯巴比妥组明显增加(P0.05),约等于对照组表达量的1.21倍。同时,苯巴比妥组中的NF-κB-P65的蛋白表达量(1.29±0.18)较对照组(0.83±0.16)明显增加(P0.05),约为对照组表达量的1.56倍。(3)PDTC对HL-7702细胞成活率的作用CCK8实验结果显示,在PDTC浓度为5、10、20、50μmol/L下,HL-7702各组细胞的存活率均在90%以上,提示NF-κB通路抑制剂PDTC预处理HL-7702细胞1小时对细胞存活率没有太大的影响。(4)NF-κB通路抑制剂PDTC对苯巴比妥激活的NF-κB-P65的抑制作用在实时荧光定量PCR实验中,加入通路抑制剂PDTC(10μmol/L)预处理HL-7702细胞1小时后与苯巴比妥共孵育24小时。实验结果显示,与苯巴比妥组相比,PDTC能抑制NF-κB-P65的mRNA表达。同时,Western blotting实验结果显示,与苯巴比妥组相比,通路抑制剂PDTC能抑制NF-κB-P65的蛋白表达。(5)通路抑制剂PDTC对苯巴比妥诱导HL-7702细胞UGT1A1 mRNA表达水平的影响实时荧光定量PCR实验结果显示,HL-7702细胞经PDTC预处理1小时,随后再与苯巴比妥共孵育24小时,与苯巴比妥组相比,PB+PDTC组中的UGT1A1 mRNA的表达(1.46±0.48)相较苯巴比妥组(1±0.06)明显增加(P0.05),约为苯巴比妥组表达量的1.46倍。(6)通路抑制剂PDTC对苯巴比妥诱导HL-7702细胞UGT1A1蛋白表达水平的影响Western blotting实验结果显示,HL-7702细胞经通路抑制剂PDTC预处理1小时,随后再与苯巴比妥孵育24小时,与苯巴比妥组相比,PB+PDTC组中的UGT1A1的蛋白表达(1.31±0.08)相较苯巴比妥组(1±0.08)显著增加(P0.05),约为苯巴比妥组表达水平的1.31倍。结论:1.苯巴比