小类泛素样修饰蛋白SUMO1诱导细胞自噬减轻酒精性肝细胞损伤的作用研究
作者单位：广西医科大学
学位级别：硕士
导师姓名：陈晖
授予年度：2021年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学]
摘 要：目的酒精诱导肝细胞发生自噬的机制及生物学意义尚未完全阐明,自噬是机体维稳的重要过程之一。其中,小类泛素样修饰蛋白1(SUMO1蛋白)借助不同的途径参与自噬的全过程。本研究主要探讨SUMO1介导的选择性自噬及其减弱酒精性肝损伤的影响的具体机制,旨在寻找通过靶向自噬的新途径治疗酒精性肝病的的有效靶点,为从自噬角度干预酒精性肝病(ALD)的治疗思路探求新的途径。方法本研究的研究对象以Huh7细胞(肝癌细胞系)作为细胞模型。(1)采用梯度时间或梯度浓度的酒精处理Huh7细胞,采用免疫印迹法(Western Blot,WB)检测SUMO1、LC3-I、LC3-II、P62蛋白的表达水平,阐明不同浓度的酒精对SUMO1蛋白及自噬标记物蛋白表达的影响。(2)利用(80m M)的酒精处理敲除或者过表达SUMO1基因的Huh7细胞,Western Blot方法检测LC3、P62的蛋白水平,以此研究SUMO1对于酒精诱导的细胞自噬体数量及自噬活性的影响。(3)3-甲基腺苷(3-methyladenine,3-MA)处理上述Huh7细胞,用Western Blot方法检测LC3、P62的蛋白水平,阐述3-MA对自噬通量的影响以及SUMO1对于自噬流的作用。(4)利用GFP-LC3标记Huh7细胞自噬泡,细胞过表达或敲降SUMO1基因,酒精预处理细胞后,利用氯喹处理,用免疫荧光方法观察GFP-LC3标记的自噬小体的细胞核周围聚集情况,阐述酒精通过SUMO1对细胞自噬通流发生阶段的影响。(5)通过梯度浓度酒精处理细胞,筛选出引起肝损酒精浓度模型;通过过表达或敲降SUMO1,再应用酒精、3-MA处理或不处理,采用ATP酶法检测细胞活力以及ELISA定量检测法检测细胞上清肝酶AST、ALT水平,共同阐述SUMO1蛋白是否能通过促进自噬的方式来拮抗酒精对肝细胞的损伤。结果1.酒精促进类泛素化修饰蛋白SUMO1的表达。用不同浓度的酒精(0 m M,40 m M,60 m M,80 m M)处理Huh7细胞72 h,以及用同一浓度的酒精(80 m M)分别处理Huh7细胞0 h,24 h,48h,72h,SUMO1蛋白水平表达呈现浓度时间依赖性,均与对照组比较有显著差异(P0.05)。2.酒精促进Huh7细胞自噬体数量增多和自噬活性增强。(1)Huh7细胞分别用梯度浓度的酒精、梯度时间处理,显著上调了LC3B-II、LC3B-II/LC3B-I水平及下调p62的蛋白水平(P0.05),且呈剂量和时间依赖性。(2)与对照组比,酒精单独处理和CQ单独处理可增加细胞核周围GFP-LC3点状聚集水平(P0.05);而CQ处理抑制后期自噬通路后再用酒精处理,GFP-LC3绿色点状聚集明显增多,显著高于单独处理组(P0.05)。***1的表达可以调控酒精诱导的Huh7细胞自噬水平。(1)过表达SUMO1,酒精上调LC3B-I向LC3B-II蛋白转化水平及清除P62蛋白的表达(P0.05);过表达SUMO1与酒精共处理显著上调GFP-LC3点状聚集程度,其显著高于酒精单独处理组(P0.05);过表达SUMO1进一步促进CQ对于自噬体的聚集能力,GFP-LC3点状聚集水平明显增多(P0.05)。(2)敲降SUMO1表达,酒精通过自噬诱导的LC3B-I向LC3B-II蛋白转化水平及清除P62蛋白的作用被显著抑制(P0.05)。敲除SUMO1与酒精共处理组下调GFP-LC3点状聚集水平,显著低于酒精单独处理组(P0.05);敲除SUMO1明显抑制了CQ对于自噬体的聚集能力,GFP-LC3点状聚集水平大幅度减少(P0.05)。***1可以上调被3-MA抑制的Huh7细胞自噬流。经酒精预处理后的Huh7细胞,3-MA处理后,再过表达SUMO1或敲除SUMO1,结果发现:过表达SUMO1可显著缓解3-MA对自噬流的抑制作用,上调Huh7细胞内LC3B-II蛋白的表达以及LC3B-I向LC3BII蛋白转化水平,促进P62蛋白降解(P0.05);而敲降SUMO1后,增加了3-MA对自噬流抑制作用,下调Huh7细胞内LC3B-II蛋白的表达以及LC3B-I向LC3BII转化,增加P62蛋白堆积(P0.05)。***1诱导的自噬作用可减轻酒精引起的肝细胞活力降低。不同浓度的酒精处理Huh7细胞,当酒精浓度达到100m M及以上时细胞活力水平大幅度降低(P0.01);过表达SUMO1基因与酒精共处理组肝细胞的活力水平增加,显著高于酒精单独处理组(P0.05);而敲除SUMO1基因与酒精共处理组,肝细胞活力水平明显下降,显著低于酒精单独处理组(P0.05);SUMO1表达可显著缓解3-MA对于肝细胞活力的毒作用(P0.05)***1诱导的自噬作
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