基于自噬的龙蛭汤含药血清抗SH-SY5Y氧化损伤的机制研究

作     者：罗燕萍 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈永斌

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：龙蛭汤含药血清 自噬 神经母细胞瘤细胞 神经元保护 

摘      要：目的:龙蛭汤可有效改善缺血性脑卒中患者的神经功能和临床症状,前期研究表明其对缺血性脑损伤大鼠神经元有保护作用,但其对神经元的保护作用机制尚未明确。通过过氧化氢(HO)诱导神经母细胞瘤(SH-SY5Y)氧化损伤,研究龙蛭汤含药血清对受损的SH-SY5Y的保护作用,进一步探讨龙蛭汤含药血清对神经元保护作用可能的机制。方法:依据中药血清药理学和药物代谢动力学方法制备龙蛭汤含药血清(LZD)和丁苯酞含药血清(NBP),应用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)、自噬诱导剂雷帕霉素(Rapamycin,RAP)干预体外构建的HO诱导的SH-SY5Y氧化损伤模型。将SH-SY5Y细胞株进行培养、传代,取处于生长对数期的SH-SY5Y与含药血清及有关药物共孵。采用CCK-8法检测不同浓度(梯度分别为0umol/L、100umol/L、200umol/L、400umol/L、800umol/L、1600umol/L)HO处理2h、4h、8h、12h、24h后对SH-SY5Y增殖的影响,选择最佳作用浓度及合适作用时间。分组设置:1.正常对照组(Control组);2.空白血清组(BS组);3.模型组(HO组);4.龙蛭汤含药血清组(LZD组);5.丁苯酞含药血清组(NBP组);***+HO组(CQ组);***+HO+LZD组(CQ+LZD组);***+HO组(RAP组);***+HO+LZD组(RAP+LZD组)。通过光学显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8检测各组SH-SY5Y增殖能力;透射电子显微镜观察细胞的自噬体和超微结构;采用免疫印迹法比较各组Beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达水平;q RT-PCR比较各组Beclin1、LC3的m RNA表达水平。阐释龙蛭汤含药血清通过调控自噬对HO诱导的SH-SY5Y细胞的氧化损伤的保护作用机制。结果:(1)当HO浓度在400umol/L时,对SH-SY5Y的细胞活性有显著抑制作用,处理4h时,细胞活力下降50%左右可通过一定条件逆转细胞状态,因此后续实验采用400umol/L浓度的HO处理4h。(2)与Control组、BS组比较,HO组细胞形态发生较大改变,细胞已经己经明显受到抑制,细胞突触大部分消失,细胞圆缩,出现聚集倾向,少数细胞尚有清晰的突触,呈片平棱形或星形。(3)与HO组比较,LZD组细胞存活率显著提高,可降低HO造成的细胞损害,维持细胞形态。较NBP组,龙蛭汤具有更高增殖能力。(4)LZD组细胞胞质内双层膜样结构增多,弯曲延展,包裹部分线粒体,而HO组细胞胞质内双层膜样结构和空泡数量相对较低,Control组与BS组细胞可见少量双层膜结构,但结构不明显,无明显变化。(5)与HO组比较,LZD组Beclin1、LC3 m RNA表达增强,Beclin1蛋白表达及LC3-II/LC3-I比值升高。(6)与HO组比较,CQ组细胞活力增强,RAP组细胞活力下降;与CQ组比较,CQ+LZD组细胞活力上升;与RAP组比较,RAP+LZD组细胞活力升高。(7)龙蛭汤含药血清协同CQ、RAP干预SH-SY5Y细胞,与CQ组相比,加入龙蛭汤后CQ+LZD组Beclin1、LC3 m RNA表达水平显著升高;与RAP组相比,RAP+LZD组的Beclin1、LC3m RNA表达水平降低。其LC3Ⅱ/Ⅰ的比值及Beclin1的蛋白含量趋势与m RNA一致。结论:龙蛭汤含药血清通过调控细胞自噬水平促进SH-SY5Y细胞增殖,减轻HO引起的细胞氧化损伤,维持细胞完整、减轻细胞老化,对神经元细胞有重要的保护作用。