运用泛素化系统降解果蝇早期胚胎中目标蛋白技术的建立

作     者：蒲婷 

作者单位：云南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张国强

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 08[工学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 0836[工学-生物工程] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：泛素-蛋白酶途径 Trim21 TRIM-Away 

摘      要：泛素化系统降解蛋白的靶蛋白技术是直接利用生物体内的泛素-蛋白酶体系统来降解蛋白。该技术能在十几分钟内快速去除内源蛋白质,用此系统来研究蛋白功能,可能比传统的基因编辑技术更准确。已知Trim21与Smurf都是E3泛素连接酶,其中Trim21与抗体的Fc段结合后招募泛素-蛋白酶体系统,而Smurf具有一个C末端Hect结构域,Hect结构域的氨基末端参与了E2的结合。所以我们选用这两个E3泛素连接酶基因,建立泛素化系统降解果蝇早期胚胎中目标蛋白的技术。同时构建新Gal4果蝇tub67c P-gvp,如此技术建立成功,就运用tub67c P-gvp果蝇启动泛素化系统在早期胚胎的较后期表达。我们分别构建Trim21、Smurf与纳米抗体片段Vhh的重组质粒,通过显微注射WT果蝇胚胎获得Trim21和Smurf-Hect转基因的果蝇品系。然后,通过一系列果蝇杂交,拿到同时带有转基因表达和需要降解的靶蛋白杂合与纯合的果蝇,通过Western blot与免疫荧光实验来确定泛素化系统对果蝇卵巢中目标蛋白的降解情况。最后,对果蝇的表型进行观察。实验证明转基因果蝇建系成功,但该系统对靶蛋白没起到降解作用,所以我们又直接在果蝇胚胎里注射GFP抗体,实验表明还是没有明显效果。从实验结果来看,此次建立的泛素化系统对果蝇早期胚胎中目标蛋白没有降解作用。我们猜测,此研究中果蝇泛素化转基因系统可能存在其他问题,需要进一步的研究。