CD7分子生物学功能的研究

作     者：盛斌捷 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：杨林

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：造血系统 肿瘤浸润 IFN-γ 肿瘤侵袭 

摘      要：CD7蛋白表达在T细胞以及NK细胞上,并且在急性淋巴细胞白血病(T-ALL)以及T细胞淋巴母细胞淋巴瘤(T-LBL)细胞上表达更高。目前CD7靶向的免疫过继疗法越来越多地应用于临床,然而,对于CD7的生物学功能以及CD7蛋白对造血系统的影响目前还并不清楚。目的:本文旨在研究CD7的生物学功能以及CD7缺失后对小鼠造血系统的影响。方法:1.利用CRISPR/Cas9技术构建了CD7基因敲除小鼠,将CD7+/-小鼠杂交得到野生鼠以及CD7-/-小鼠。2.对小鼠免疫器官伊红苏木精染色(H&E)并检测脏器重量、细胞数。选择小鼠的胸腺细胞以及骨髓中的NK细胞进行RN A-sequence分析。在体外检测小鼠脾脏、胸腺细胞的增殖能力,以及小鼠胸腺细胞的迁移、粘附能力。3.利用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测小鼠骨髓中造血系统各种类型细胞占比、胸腺中T细胞发育过程各种类型细胞占比以及脾脏中各类免疫细胞占比。利用五分类血细胞分析仪检测小鼠外周血细胞占比。4.皮下接种B16-F10细胞,利用流式细胞术检测接种肿瘤后小鼠肿瘤以及脾脏中各类免疫细胞占比,提取胸腺以及脾脏细胞的RNA,利用Q-PCR检测细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-2的相对表达含量。通过流式分选的方法分选脾脏的CD8+T细胞,在体外检测其对B16-F10肿瘤细胞的杀伤能力、迁移、侵袭、粘附以及细胞因子的相对表达含量。5.利用胞内阻断的方式(Protein Expression Blocker,PEBL)构建CD7-的正常供者外周血T细胞,利用流式细胞术检测T细胞表面常见膜蛋白以及细胞凋亡、细胞周期,体外检测其迁移、趋化、粘附以及粘附相关基因的相对表达含量。并构建阻断CD7蛋白的CAR-T细胞并持续检测其对胰腺癌肿瘤细胞株的杀伤能力。6.利用胞内阻断的方式构建CD7-的肿瘤细胞株,通过流式细胞术检测肿瘤细胞株表面常见膜蛋白以及细胞凋亡、细胞周期,体外检测其迁移、趋化、粘附以及粘附相关基因的相对表达含量。通过尾静脉注射肿瘤细胞到免疫缺陷小鼠(NSG),观察小鼠生存期、体重以及外周血肿瘤负荷,最后处死小鼠检测小鼠脏器的肿瘤浸润情况。结果:1.成功获得CD7-/-小鼠,RNA-sequence结果显示CD7的缺失造成小鼠胸腺细胞与胞外基质的相互作用以及焦点粘附作用相关基因下调。2.在正常生理条件下,小鼠造血系统、胸腺、脾脏各类型细胞占比均正常。3.接种B16-F10细胞后,CD7-/-小鼠肿瘤体积增长更快,脾脏以及肿瘤中的CD8+T细胞占比减少。4.接种B16-F10细胞后,CD7-/-小鼠脾脏CD8+T细胞的侵袭粘附能力减弱。5.阻断CD7后的正常供者外周血T细胞粘附等能力与正常外周血T细胞相比没有显著差异。6.阻断CD7后的肿瘤细胞侵袭、粘附能力减弱。在NCG小鼠中阻断CD7后的肿瘤细胞更多的富集在肝脏中。结论:本文发现了 CD7基因的缺失并不影响小鼠造血系统的发育,对小鼠的生长也没有影响。本文阐明了 CD7的生物学功能以及发挥作用的条件,为临床评估靶向治疗后CD7缺失可能会引起的副作用提供了理论依据。最后,本文发现了阻断CD7后的肿瘤细胞侵袭能力减弱,对经CD7靶向治疗后阴性复发患者的后续治疗具有重要意义。