LASS2/TMSG1通过合成神经酰胺诱导人肺癌细胞自噬的机制研究

作     者：郑泽泽 

作者单位：内蒙古医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：徐晓艳;宣成睿

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：LASS2/TMSG1 肺癌 自噬 神经酰胺 JNK(SAPK)通路 Beclin1 LC3 

摘      要：目的LASS2/TMSG1是新近发现的一种肿瘤转移抑制基因,可抑制肿瘤增殖、侵袭及转移等,其具有HOX和TLC两个功能域,其中TLC功能域可能参与诱导神经酰胺的合成。神经酰胺（Ceramide）不仅是存在于真核细胞中的一种脂质,同时也是一种可以调节细胞生长、分化和自噬的生物活性物质。基于超高效液相色谱串联质谱方法对人肺癌细胞中LASS2/TMSG1基因诱导合成的神经酰胺进行定性定量分析,明确LASS2/TMSG1基因诱导合成的神经酰胺的类型以及各型神经酰胺含量之间是否有差异,并探讨神经酰胺是否参与诱导人肺癌细胞自噬及相关分子机制。方法采用慢病毒感染实验构建LASS2/TMSG1基因沉默细胞株;采用脂质体转染方法构建LASS2/TMSG1基因过表达细胞株;采用超高效液相色谱串联质谱方法检测LASS2/TMSG1基因诱导合成神经酰胺的类型及含量的变化情况;采用细胞自噬MDC法检测LASS2/TMSG1基因沉默及过表达前后对人肺癌细胞自噬囊泡的影响;采用AO染色方法检测LASS2/TMSG1基因沉默及过表达前后对人肺癌细胞自噬小体的影响;采用Western blot法检测LASS2/TMSG1基因沉默及过表达前后人肺癌细胞中JNK、p-JNK、c-Jun、p-c-Jun、Beclin1、LC3的蛋白表达水平;运用SPSS22.0统计软件对数据进行分析处理,采用单因素方差分析三组样本均数是否有差异,然后进行样本间两两比较。p0.05表示差异显著,具有统计学意义。结果（1）LASS2/TMSG1基因沉默组中的LASS2/TMSG1m RNA及蛋白水平显著低于空白对照组和阴性对照组（实时荧光定量PCR法:F=17.457,P=0.001;P沉默组-空白对照组=0.002;P沉默组-阴性对照组=0.003;Western blot法:F=13.631,P=0.000;P沉默组-空白对照组=0.001;P沉默组-阴性对照组=0.000）。LASS2/TMSG1过表达组中的LASS2/TMSG1m RNA及蛋白表达水平与此相反(实时荧光定量PCR法:F=43.520,P=0.000;P过表达组-空白对照组=0.000;P过表达组-阴性对照组=0.000;Western blot法:F=5.145,P=0.023;P=0.009;P=0.029)。MDC染色结果显示,LASS2/TMSG1基因沉默组中的自噬囊泡数量显著低于空白对照组和阴性对照组（F=19.696,P=0.000;P沉默组-空白对照组=0.000;P沉默组-阴性对照组=0.001）;LASS2/TMSG1基因过表达组中的自噬囊泡数量显著多于空白对照组及阴性对照组(F=24.422,P=0.000;P=0.000;P=0.000)。AO染色结果显示,LASS2/TMSG1基因沉默组自噬小体数量显著低于空白对照组及阴性对照组（F=13.088,P=0.006;P沉默组-空白对照组=0.004;P沉默组-阴性对照组=0.005）;LASS2/TMSG1基因过表达组中的自噬小体数量显著多于空白对照组及阴性对照组(F=18.781,P=0.003;P=0.002;P=0.001)。液相色谱串联质谱方法对细胞内20种神经酰胺进行分析,结果显示,LASS2/TMSG1基因沉默组细胞内神经酰胺总含量及d18:1/20:0、d18:1/22:0、d18:1/24:0、d18:1/24:1和d18:1/26:0含量显著低于空白对照组及阴性对照组(F=32.154,P=0.001;P=0.000;P沉默组-阴性对照组=0.001。Fd18:1/20:0=5.669,P=0.041;P沉默组-空白对照组=0.034;P沉默组-阴性对照组=0.022。Fd18:1/22:0=12.626,P=0.007;P沉默组-空白对照组=0.003;P沉默组-阴性对照组=0.009。Fd18:1/24:0=52.056,P=0.000;P沉默组-空白对照组=0.000;P沉默组-阴性对照组=0.000。Fd18:1/24:1=6.392,P=0.033;P沉默组-空白对照组=0.014;P沉默组-阴性对照组=0.042。Fd18:1/26:0=16.263;P=0.004;P沉默组-空白对照组=0.003;P沉默组-阴性对照组=0.002);LASS2/TMSG1基因过表达组神经酰胺总含量及d18:1/20:0、d18:1/22:0、d18:1/24:0、d18:1/24:1和d18:1/26:0含量与LASS2/TMSG1沉默组结果相反(F=23.893,P=0.001;P过表达组-空白对照组=0.001;P过表达组-阴性对照组=0.001。Fd18:1/20:0=36.385,P=0.001;P过表达组-空白对照