黄芪甲苷Ⅳ调控巨噬细胞极化在炎症性肠病进展中的作用及机制研究

作     者：田莲莲 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：江逊;林燕

授予年度：2021年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：DSS IBD AS-Ⅳ 巨噬细胞 极化 STAT 

摘      要：研究背景炎症性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一类多种病因引起的,异常免疫介导的肠道慢性复发性炎症,表现为腹痛、腹泻、便血,有终生复发倾向。克罗恩病(Crohn’s disease,CD)、溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)为其主要疾病类型。随着城市化和工业化进程,我国发病率与患病率都不断上升。IBD发病机制涉及环境、遗传、免疫、肠道微生物群,但仍不清楚,因此导致治疗效果不佳。IBD的治疗主要包括5-氨基水杨酸(5-aminosalicylic acid,5-ASA)、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂等。但是这些药物治疗效果不佳,只能减轻炎症、缓解病情,病情仍会反复发作;且不良反应较多;此外,生物制剂存在药物无反应性、长期应用不耐受性和价格昂贵等弊端。因此探索一种疗效更好、不良反应更少且价格合理的替代药物或新型药物具有重要的临床应用价值。近年来,中药在IBD治疗中的作用日益受到重视。黄芪是最常用中药之一,具有补气固表、托毒排脓、敛疮生肌的作用,广泛用于各种疾病的治疗。黄芪甲苷Ⅳ(Astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ)作为黄芪的主要活性成分,具有缺血保护、抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗糖尿病、免疫调节等药理作用,常用于各种疾病的治疗。研究表明AS-Ⅳ可通过调控巨噬细胞极化抑制肺癌进展和转移;可通过上调替代激活巨噬细胞而促进糖尿病伤口愈合;可通过调控经典激活巨噬细胞极化改善类固醇激素引起的股骨头坏死;这些研究表明AS-Ⅳ可通过调控巨噬细胞而对其他疾病具有治疗效果。此外研究表明,AS-Ⅳ可减轻实验性结肠炎,但是具体机制不清,因此探索AS-Ⅳ对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的实验性结肠炎的疗效及作用机制具有重大临床意义。胃肠道黏膜是人体内最大的巨噬细胞池。肠道巨噬细胞主要位于固有层,其更新主要来源于循环中的单核细胞,以CC趋化因子受体2依赖的方式被招募到固有层以补充巨噬细胞池。巨噬细胞作为固有免疫中的重要免疫细胞,可简单分为经典激活巨噬细胞(M1型)和替代激活巨噬细胞(M2型),M1和M2型巨噬细胞是不同的极化激活状态。M1型巨噬细胞通过产生大量炎性细胞因子、趋化因子(chemokine,CCL)、活性氧、一氧化氮等介质导致组织损伤,并引发强烈免疫反应而参与到结肠炎的发展。M2型巨噬细胞可通过分泌IL-10和TGF-β促进2型辅助性T细胞反应和组织修复,还可抑制免疫反应从而参与维持肠道稳态。上述M1和M2型巨噬细胞的极化过程涉及多种信号通路,例如Janus激酶-信号转导和转录激活因子(Janus kinases-signal transducer and activator of transcription,JAK-STAT)通路、Toll样受体4-丝裂原活化蛋白激酶(Toll-like receptor 4-mitogen-activated protein kinase,TLR4-MAPK)通路、Toll样受体4-核转录因子-κB(Toll-like receptor 4-nuclear factor-κB,TLR4-NF-κB)通路、Delta样4-Notch(Delta-like 4-Notch,DLL4-Notch)通路等。其中STAT蛋白对于巨噬细胞极化至关重要,例如STAT1磷酸化后入核,可介导巨噬细胞向M1型极化,而STAT3则介导M2型巨噬细胞极化。研究表明巨噬细胞以极化的方式参与肠道炎症反应。IBD中M1型巨噬细胞增多,M2型巨噬细胞减少,M1与M2平衡向促炎方向改变。因此本研究的意义在于明确AS-Ⅳ对实验性结肠炎的疗效及作用机制,明确AS-Ⅳ是否通过调控巨噬细胞极化从而缓解IBD进展。研究目的探索AS-Ⅳ对DSS诱导的小鼠实验性结肠炎的作用及其机制。研究方法1.建立DSS实验性结肠炎模型:40只6-8周雄性C57BL/6小鼠随机分为空白对照组、DSS模型组、AS-Ⅳ 50 mg/kg组、AS-Ⅳ 100 mg/kg组、5-ASA 150 mg/kg组。除空白对照组外,其余四组均连续5天饮用2.5%DSS,5天后更换为滤过除菌水建立急性实验性结肠炎模型。AS-Ⅳ 50 mg/kg组、AS-Ⅳ 100 mg/kg组和5-ASA 150mg/kg组小鼠分别给予AS-Ⅳ 50 mg/kg、AS-Ⅳ 100 mg/kg和5-ASA 150 mg/kg灌胃处理;空白对照组、DSS模型组每天给予等量0.5%羧甲基纤维素钠(carboxyl methyl cellulose,CMC)灌胃处理。每天一次,共10天。第10天时心脏灌注处死小鼠取材。2.治疗效果评价:每日观察小鼠一般情况、粪便性状、粪便隐血情况;固定时间记录小鼠体重;并对小鼠结肠炎症进行评估,包括结肠长度变化、疾病活动指数(disease activity index,DAI)评分、组织病理学结果及其评分;测定结肠组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)、促炎因子(IL-1β、TNF-α)和抗炎因子(TGF-β、IL-10)表达水平。3.机制研究:通过RT-PCR技术检测结肠组织和骨髓来源的M1型和M2型巨噬细胞相关因子或基因表达量;通过免疫荧光技术和流式细胞术检测肠道巨噬细胞亚群(M1型和M2型)变化;通过蛋白免疫印迹(western blot,WB)检测结肠组织中和骨髓来源的M1型和M2型巨噬细胞STAT蛋白表达水平。研究结果1.与空白对照组相比,DSS模型组小鼠一般情况较差,体重降低,DAI评分升高,结肠长度缩短,肠道黏膜损伤严重且病理评分升高,MPO和炎性细胞因子增加,抗炎细胞因子减少(P0.05),提示造模成功。与DSS模型组相比,AS-Ⅳ治疗组小鼠体重降低程度减轻、DAI评分降低、结肠缩短得到轻微改善、病理损伤减轻、MPO和炎性细胞因子水平下降,抗炎细胞因子水平升高(P0.05),提示AS-Ⅳ对小鼠实验性结肠炎具有一定的治疗作用。2.在mRNA水平上,与DSS模型组相比,AS-Ⅳ治疗组结肠组织中M1型巨噬细胞相关因子诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)、IL-1β、IL-6、IL-12、TNF-α、表达降低,M2型巨噬细胞相关因子或基因Mrc、IL-10、TGF-β表达增加(P0.05)。体外实验中,诱导分化的M1型巨噬细胞,其相关因子i NOS、IL-12、IL-1β、IL-6、TNF-α在m RNA水平上高于M0和M2组;与PBS组相比,AS-Ⅳ 100μM组可下调i NOS、IL-12、IL-1β、IL-6、TNF-α表达(P0.05)。在m RNA水平上,诱导分化的M2型巨噬细胞,其相关因子或基因TGF-β、Arg1、Ym1、Mrc表达高于M0和M1型巨噬细胞;AS-Ⅳ 100μM组较PBS组TGF-β、Arg1、Ym1、Mrc、IL-10表达增加(P0.05)。免疫荧光结果显示AS-Ⅳ治疗组较DSS模型组结肠组织中F4/80CD206双阳性细胞(M2型)增加。流式细胞术结果显示,与DSS模型组相比,AS-Ⅳ治疗组M1型巨噬细胞极化下调,M2型巨噬细胞极化上调。提示AS-Ⅳ可以抑制M1型巨噬细胞极化,促进M2型巨噬细胞极化。3.WB结果显示,与DSS模型组相比,AS-Ⅳ治疗组结肠组织中磷酸化STAT1表达降低,而磷酸化STAT3表达增加。体外实验中,AS-Ⅳ处理组较PBS组磷酸化STAT1表达降低,而磷酸化STAT3表达增加。提示AS-Ⅳ可以抑制STAT1蛋白磷酸化,促进STAT3蛋白磷酸化。结论AS-Ⅳ可减轻小鼠急性实验性结肠炎,而这一作用是通过抑制STAT1磷酸化、促进STAT3磷酸化使得巨噬细胞M1型极化减少、M2型极化增加实现的。体外实验也验证了AS-Ⅳ通过调控STAT蛋白对于巨噬细胞极化的影响。本研究初步探讨了AS-Ⅳ对实验性结肠炎的治疗作用和机制,为IBD的治疗提供了新的观点与思路。