新型豆荚蛋白酶靶向PET探针的设计合成及生物学评价

作     者：陆春梅 

作者单位：江南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邱玲;林建国

授予年度：2022年

学科分类：1007[医学-药学(可授医学、理学学位)] 081704[工学-应用化学] 07[理学] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 070302[理学-分析化学] 0703[理学-化学] 100701[医学-药物化学] 10[医学] 

主      题：豆荚蛋白酶 肿瘤诊断 正电子发射计算机断层扫描 氟-18标记探针 分子内缩合 

摘      要：随着癌症发病率与死亡率的逐年提升,如何在癌症早期对其进行精确有效的诊断来提高患者的生存率成为我们面临的一大挑战。对肿瘤生物标志物的精确检测可促使早期癌症诊断成为可能,有利于提高患者的生存率和治愈率。豆荚蛋白酶(legumain)已被证实是一种重要的生物标志物,在乳腺癌、结肠癌、胃癌等多种常见的癌症中表达水平较高,与肿瘤的发生和发展、侵袭与转移有着密不可分的关联。因此,准确检测体内各组织器官的legumain活性,可以有效实现对肿瘤的精确定位,从而对提高癌症早期诊断水平具有重要意义。分子影像技术的快速发展为活体内疾病的快速、精确诊断提供了重要支撑,尤其是正电子发射计算机断层扫描(PET)因具有较高的灵敏度和较强的组织穿透能力等优势,已被广泛应用于临床。基于此,本研究设计合成了三个靶向legumain的新型PET探针,以期对活体内legumain表达水平进行灵敏特异地精准检测。(1)首先基于本课题组目前研究的探针骨架SF,设计合成了靶向legumain的目标探针[F]SF-AAN,具有较高的标记产率、放射性化学纯度、摩尔活度以及良好的体内外稳定性。在体外利用非放射性探针[F]SF-AAN验证了该探针在还原条件下可快速响应legumain酶,发生剪切、分子内缩合形成环化产物。通过体外细胞摄取、荧光定量和共聚焦实验表明了该探针具有良好的靶向特异性,可区分不同legumain表达水平的肿瘤细胞,并且可在legumain高表达的乳腺癌MDA-MB-468细胞内被GSH和legumain识别剪切形成分子内缩合产物。体内PET显像研究结果显示,[F]SF-AAN在legumain高表达的MDA-MB-468荷瘤鼠体内具有较好的显像效果。该探针通过尾静脉注射到体内10 min,肿瘤摄取就能达到最高4.22±0.40%ID/m L,并且能清晰地观察到肿瘤图像;60 min时,探针的肿瘤/肌肉摄取比仍然高达2.26±0.18。此外,在legumain低表达的前列腺癌PC-3荷瘤鼠中,探针在肿瘤部位几乎没有摄取,与肌肉摄取基本相当,表明探针[F]SF-AAN对legumain具有良好的靶向特异性。MDA-MB-468和PC-3荷瘤鼠的肿瘤和肌肉放射性自显影结果再次验证了该探针具有良好的靶向特异性。通过研究探针在MDA-MB-468荷瘤鼠体内的生物分布也可得出,[F]SF-AAN具有良好的靶向特异性,但由于该探针偏亲脂性,故在肝脏、肠道这些代谢器官中也有所积累。(2)由于探针[ F]SF-AAN在肿瘤处滞留时间不长,限制其临床应用。因此,对探针[F]SF-AAN的化学结构进行优化,以延长其在肿瘤处的滞留。研究表明吗啉基团靶向溶酶体,因此将探针底物封端乙酰基替换为吗啉,可增强探针靶向溶酶体的能力,有利于探针靶向肿瘤细胞,从而识别响应过表达的legumain,并进一步发生分子内缩合,生成刚性和疏水性的环化产物,降低探针被泵出细胞的可能性。因此,我们设计合成了新型PET探针[F]SF-AAN-M,该探针同样具有优良的体内外稳定性和生物相容性。通过体外研究验证了非放射性探针[F]SF-AAN-M同[F]SF-AAN一样可快速响应legumain生成分子内缩合产物;通过体外细胞摄取实验确定[F]SF-AAN-M具有更佳的靶向特异性。在legumain过表达的MDA-MB-468细胞中,探针[F]SF-AAN-M的细胞摄取在4 h时达到最高4.34±0.22%;相对于探针[F]SF-AAN(3.76±0.19%)而言,该探针在MDA-MB-468细胞中的摄取显著提高。MDA-MB-468荷瘤鼠体内PET成像显示,给药后35 min探针在肿瘤中摄取达到最高4.23±0.18%ID/m L,且在肿瘤处有良好的滞留效应;60 min时,探针在MDA-MB-468肿瘤处的摄取依然高达3.95±0.29%ID/m L。该研究表明,引入溶酶体靶向基团吗啉确实有利于提高探针的靶向特异性,促进探针进入MDA-MB-468肿瘤细胞内响应过表达的legumain酶,生成更多疏水性和刚性的分子内环化产物,有效地延长了探针在肿瘤位置的滞留,更有利于提高癌症的早期诊断水平。(3)由于探针[ F]SF-AAN-M在肝脏等非靶器官中的摄取较高,对于肿瘤的精确定位和癌症的准确诊断有所影响。研究表明,引入HEHEHE亲水序列(组氨酸-谷氨酸-组氨酸-谷氨酸-组氨酸-谷氨酸)可降低肝脏对探针的非特异性摄取,而不影响肿瘤的特异性摄取。因此,我们在探针[F]SF-AAN-M的结构基础上引入了亲水序列HEHEHE,设计合成了一种新型靶向legumain的PET探针[F]SF-AAN-HEM。体外研究表明,该探针可快速识别响应肿瘤细胞内过表达的legumain酶,发生剪切、分子内缩合形成刚性和疏水性的环化产