金水缓纤组分方通过调控SETDB1/Snai1表观抑制肺泡上皮细胞间质转化机制

作     者：许朋俐 

作者单位：河南中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李建生;刘田田

授予年度：2022年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：特发性肺纤维化 金水缓纤组分方Ⅱ SETDB1 上皮间质转化 Snai1 

摘      要：目的1评价金水缓纤组分方II(Effective-component compatibility of Jinshui Huanxian formulaⅡ,ECC-JHF II)对博来霉素(Bleomycin,BLM)制备的肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)大鼠的干预效应,初步探讨其通过调控SETDB1抑制肺纤维化上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的机制。2阐释ECC-JHF II通过表观调控Snai1表达,抑制转化生长因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)诱导的人肺泡上皮细胞(A549)上皮间质转化的作用机制。方法第一部分金水缓纤组分方Ⅱ对PF大鼠的干预作用1 PF大鼠模型建立及药物干预将48只SD大鼠按随机数字表法分为4组,分别为:正常组(Control)、模型组(Model)、吡非尼酮(Pirfenidone,PFD)组和ECC-JHF II组,每组12只,雌雄各半。采用一次性气管内滴注BLM的方法建立PF大鼠模型。于第0天给予气管内滴入BLM,滴入量为5 mg/kg。正常饲养大鼠至第28天。第29～42日每天给予药物灌胃1次,正常组及模型组给予0.5%羧甲基纤维素-钠(CMC-Na)溶媒灌胃(0.5 m L/100 g);治疗组分别给予PFD混悬液(108 mg/kg/d,0.5 m L/100g)和ECC-JHF II(4.72 mg/kg/d,0.5 m L/100 g)灌胃,第42天给药结束后进行动物取材。2指标检测通过HE及Masson染色观察大鼠肺组织病理结构及肺纤维化情况;采用蛋白免疫印迹法(Western blot,WB)和免疫组化方法检测大鼠肺组织中SETDB1及H3K9me3的表达情况。第二部分组蛋白甲基转移酶SETDB1表观调控Snai1表达,抑制肺泡上皮细胞间质转化1 TGF-β1诱导细胞模型的建立以人肺泡上皮细胞(A549)为对象,采用蛋白免疫印迹法检测不同时间点、不同浓度TGF-β1对SETDB1、H3K9me3及EMT相关标志蛋白E-钙粘蛋白(Ecadherin,E-cad)、N-钙粘蛋白(N-cadherin,N-cad)、纤维连接蛋白(Fibronectin1,FN1)、波形蛋白(Vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-Smooth Muscle Actin,α-SMA)的表达,筛选出TGF-β1的最佳浓度和最佳作用时间,建立细胞模型。2 siRNA敲低SETDB1对EMT相关蛋白的作用评价将A549细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+NC组和TGF-β1+si-setdb1组,采用WB及q PCR方法检测SETDB1、H3K9me3和EMT相关基因和蛋白(E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、FN1、Snai1)的表达;采用细胞免疫荧光方法检测E-cadherin与FN1蛋白的表达。3过表达SETDB1对EMT相关蛋白的作用评价将A549细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+cmv组和TGF-β1+setdb1组,采用WB法检测SETDB1、H3K9me3和EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、FN1、Snai1)的表达。4 SETDB1对Snai1的表观调控作用将A549细胞分为对照组和TGF-β1诱导组,用染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,Ch IP)实验检测SETDB1调控Snai1基因启动子上H3K9me3的水平变化。第三部分金水缓纤组分方Ⅱ通过调控SETDB1/Snai1改善肺泡上皮细胞间质转化1 ECC-JHFⅡ浓度筛选及疗效评价以A549细胞为研究对象,给予不同浓度ECC-JHFⅡ处理,采用CCK8方法检测细胞活性,筛选出ECC-JHFⅡ的浓度范围。以TGF-β1诱导的A549细胞为研究对象,分为对照组、TGF-β1组和TGF-β1+不同浓度ECC-JHFⅡ处理组,采用WB方法检测不同浓度ECC-JHFⅡ对A549细胞EMT相关蛋白(E-cadherin、N-cadherin、α-SMA、Vimentin、FN1、Snai1)表达的影响。2 ECC-JHFⅡ对SETDB1、H3K9me3及EMT相关蛋白的调控作用评价将细胞分为对照组、TGF-β1组、TGF-β1+ECC-JHFⅡ组和TGF-β1+PFD组,采用WB方法检测61.25μg/m L ECC-JHFⅡ对SETDB1、H3K9me3及EMT相关蛋白表达的影响。3 ECC-JHFⅡ对SETDB1表观调控Snai1的作用评价将细胞分为对照组、TG