不同结构的羊栖菜多糖对基质金属蛋白酶抑制活性的影响研究

作     者：胡金红 

作者单位：华南理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：游丽君;马永轩

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083204[工学-水产品加工及贮藏工程] 

主      题：羊栖菜 多糖 抗光老化 结构表征 基质金属蛋白酶MMPs HaCaT细胞 

摘      要：羊栖菜(Sargassum fusiforme)是我国主要的经济食用海藻之一,具有丰富的生物活性。课题组前期研究发现,羊栖菜多糖具有显著的抗光老化活性,但其结构与抗光老化活性之间的关系尚不明确。基质金属蛋白酶(MMPs)能特异性降解细胞外基质,使皮肤产生皱纹和松弛,导致皮肤的光老化,常被用来评估皮肤的光老化程度。因此,本文分别采用UV/HO、藻酸盐裂解酶和0.1 M盐酸修饰羊栖菜纯化多糖P1的结构,通过降低分子量、断开主链和去除支链,研究羊栖菜多糖的结构对其抑制基质金属蛋白酶MMPs的影响。主要研究结果如下:(1)通过水提法制备羊栖菜粗多糖,采用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析法对其进行分离纯化得到羊栖菜纯化多糖P1,采用二维核磁鉴定其精确结构,并通过HaCaT细胞模型评价其抗光老化活性。P1的分子量为289 k Da,主要由甘露糖醛酸(45.04%)、古罗糖醛酸(13.81%)和岩藻糖(4.96%)组成,硫酸基(1.00%)和蛋白质(0.68%)含量较低。根据甲基化和二维核磁结果对P1的精确结构进行解析,P1的主链为→4)-β-Man A-(1→4)-α-Gul A-(1→4)-β-Man A-(1→4)-β-Man A-(1→4)-α-Gul A-(1→4)-β-Ma n A-(1→3,4)-β-Man A-(1→,侧链α-Fucp-(1→连接在→3,4)-β-Man A-(1→的O-3位置。推测P1的分子式为(CHO),重复结构单元数n为278,M/G约为2.5。细胞实验表明,P1能够显著抑制UVB辐照HaCaT细胞内基质金属蛋白酶MMP-1、MMP-3、MMP-9的表达,减少自由基ROS的含量来发挥抗光老化作用。(2)通过UV/HO法降解羊栖菜纯化多糖P1,制备不同分子量的多糖,探究分子量对多糖抑制MMPs活性的影响。UV/HO降解15、30、60和240 min的产物P1-15、P1-30、P1-60和P1-240平均分子量分别为118、73、34和10 k Da。降解过程中,硫酸基、蛋白质和总糖含量降低,还原糖和糖醛酸含量升高。降解后增加了游离羧基和C≡C的结构,甘露糖醛酸的含量提高,古罗糖醛酸和岩藻糖的含量降低。细胞实验结果表明,在分子量10 k Da的条件下,分子量越低,羊栖菜多糖对MMPs(MMP-1、MMP-3和MMP-9)和ROS的抑制效果越强,抗光老化活性越强。(3)采用藻酸盐裂解酶水解P1的主链,制备具有不同主链结构的多糖,探究主链结构对羊栖菜多糖抑制MMPs活性的影响。酶解时间(min)与分子量(k Da)的关系式为y=1414.4x(R=0.9983)。藻酸盐裂解酶水解15、30、60和120 min的产物A-15、A-30、A-60和A-120的分子量分别为87、29、12和5 k Da。细胞实验结果表明,主链结构能够显著影响羊栖菜多糖抑制基质金属蛋白酶MMPs的活性。其中,藻酸盐裂解酶水解30 min时,多糖A-30对基质金属蛋白酶MMPs(MMP-1、MMP-3和MMP-9)和ROS的抑制效果最强。对A-30的精确结构进行表征,发现藻酸盐裂解酶并不改变P1的主链和支链主要重复单元的结构,多糖A-30的主链结构为→4)-β-Man A-(1→4)-α-Gul A-(1→4)-β-Man A-(1→4)-β-Man A-(1→4)-α-Gul A-(1→4)-β-Ma n A-(1→3,4)-β-Man A-(1→,侧链α-Fucp-(1→连接在→3,4)-β-Man A-(1→的O-3位置。推测A-30的分子式为(CHO),重复结构单元数降n为28。藻酸盐裂解酶主要水解了→4)-β-Man A-(1→,酶水解的片段为→4)-β-Man A-(1→4)-α-Gul A-(1→4)-β-Man A-(1→。降低主链的重复单元数可以有效提高羊栖菜多糖对MMPs的抑制活性,当重复单元数从278个降为28个时,抗光老化活性最强。(4)通过盐酸水解P1去除支链,探究支链的存在与否对羊栖菜多糖抑制MMPs活性的影响。水解产物P1-HCl的分子量为7 k Da。对其精确结构进行表征,推测P1-HCl的分子式为(CHO),主要结构重复单元数n为8,主链结构为→4)-β-Man A-(1→4)-α-Gul A-(1→4)-β-Man A-(1→4)-β-Man A-(1→4)-α-Gul A-(1→4)-β-Ma n A-(1→4)-β-Man A-(1→,说明酸水解后去除了P1的支链α-Fucp-(1→,但并未改变P1主链的结构。细胞实验结果表明,除去支链α-Fucp-(1→能够提高羊栖菜多糖对MMPs的抑制作用,表明羊栖菜多糖的抗光老化作用主要由其主链片段发挥。本文比较了羊栖菜多糖的分子量、主链和支链结构对HaCaT细胞内MMPs和ROS抑制效果的影响,发现降低分子量、调控主链重复单元数和去除支链均能有效提高羊栖菜多糖对MMPs的抑制作用,影响活性的程度排序为:主链重复单元数分子量支链存在与否。主链结构是羊栖菜多糖抑制MMPs活性的主要因素,当主链的重复单元数为28时,多糖A-30(29 k Da)对MMPs的抑制效果最强,抗光老化活性最好。当浓度为125μg/m L时,MMP-1、MMP-3、MMP-9和ROS的含量分别是模型组的32.74%、22.20%、29.34%和20.40%。