布鲁氏菌双抗原多糖结合疫苗的研究

作     者：裴美娟 

作者单位：锦州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王玉飞

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：布鲁氏菌 多糖结合疫苗 霍乱毒素 MHC结合肽 Omp19 

摘      要：背景布鲁氏菌病对我国的人民健康、经济发展和生物安全造成了较大威胁,疫苗免疫是预防和控制布鲁氏菌感染的主要手段。目前常用的布鲁氏菌疫苗为减毒活疫苗,但是由于其安全性问题,很少用于人的免疫预防,至今尚无国际认可的人用布鲁氏菌疫苗。研发安全高效的新型布鲁氏菌疫苗已经成为一个亟待解决的问题。目的利用细菌糖基化系统,在小肠结肠炎耶尔森氏菌中制备布鲁氏菌O-抗原多糖-载体蛋白结合物;同时,利用大肠杆菌表达蛋白抗原Omp19,进一步将二者通过体外结合和物理混合的方式,制备同时具有蛋白抗原和多糖抗原的新型亚单位疫苗。此外,为了提高蛋白抗原的保守性和有效性,对布鲁氏菌表位肽进行了筛选鉴定,为布鲁氏菌的亚单位疫苗研究提供了抗原靶标。方法1.利用霍乱毒素(CTA2蛋白与CTB蛋白)体外结合特性制备布鲁氏菌多糖结合疫苗的过程中,首先构建了Omp19融合CTA2蛋白表达质粒、CTB蛋白表达。然后经过蛋白纯化得到Omp19-CTA2蛋白和CTB蛋白。最后使用两种方法进行CTA2和CTB结合:酸变性,碱-尿素复性法、酸变性-碱复性法。2.利用Spy Catcher和Spy Tag体外偶联特性制备布鲁氏菌多糖结合疫苗的过程中,首先构建了Say Tag肽标签融合Omp19质粒并进行蛋白纯化。同时将实验室已经构建好的Spy Catcher融合蛋白进行蛋白纯化。最后Spy Catcher和Spy Tag蛋白按照不同摩尔比,在1×PBS中4℃反应过夜,探索两者反应的最佳比例。3.利用物理混合双抗原的方法制备布鲁氏菌多糖结合疫苗,首先构建了Omp19蛋白表达质粒并经过蛋白纯化得到蛋白单体,以及CTB-OPS糖蛋白。将两种蛋白混合后对小鼠进行皮下注射,分别在第0、14、28天进行第一次、第二次、第三次免疫。其中Omp19蛋白的免疫剂量为20μg,CTB-OPS的免疫剂量为2.5μg/只。在每次完成免疫后的一周进行鼠尾静脉取血,第二天分离血清,进行Ig G抗体效价测定。第三次免疫完成后的第10天进行布鲁氏菌的感染,感染的剂量为致病菌对小鼠不致死的最大量,在感染后的第6天对脾脏细菌载菌量进行计算。4.牛种布鲁氏菌感染小鼠后分离感染小鼠的PMBC细胞,通过抗体免疫共沉淀富集MHC结合肽,并利用质谱技术鉴定布鲁氏菌中能够与小鼠MHC结合的抗原表位肽。结果1.在利用霍乱毒素CTA2-CTB的体外结合特性制备布鲁氏菌双抗原多糖结合疫苗的研究过程中,我们成功构建了CTA2融合Omp19蛋白表达质粒,并且经过纯化可获得纯度较高的蛋白。2.在利用Spy Catcher-Spy Tag的体外结合特性制备布鲁氏菌双抗原多糖结合疫苗的研究过程中,我们成功构建了Spy Tag标签融合Omp19蛋白表达质粒,并且能够经蛋白纯化后得到目标蛋白。体外结合预实验结果表明,Spy CatcherSpy Tag构建双抗原多糖结合疫苗是可行的。3.在利用体外混合双抗原的方法制备布鲁氏菌多糖结合疫苗的研究过程中,我们成功构建了Omp19蛋白表达质粒,并且在蛋白纯化后能够得到相应的目标蛋白。当免疫抗原为糖蛋白时,无需其他佐剂,在致死剂量感染后小鼠的生存率最高,为80%。当免疫抗原仅为蛋白抗原时,混入铝佐剂后产生的抗体滴度最高,小鼠脾脏中病原菌的数量最少。当糖蛋白与蛋白物理混合后的小鼠生存率降有所低,为60%。4.在布鲁氏菌表位肽筛选鉴定的研究过程中,利用质谱技术鉴定了布鲁氏菌中能够与小鼠MHC结合的抗原表位肽。其中19个肽段与MHC-Ⅰ分子有关,16个肽段与MHC-Ⅱ分子有关。结论在布鲁氏菌双抗原多糖结合疫苗的研究过程中,利用Spy Catcher-Spy Tag体外结合的方法是可行的。结合质谱技术和生物信息学分析,成功鉴定出35个布鲁氏菌的抗原表位肽。