冠心病不稳定型心绞痛肾虚血瘀证差异miRNA-mRNA的筛选和验证

作     者：刘兰椿 

作者单位：北京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王阶

授予年度：2022年

学科分类：100506[医学-中医内科学] 1006[医学-中西医结合] 1005[医学-中医学] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：冠心病不稳定型心绞痛 肾虚血瘀 补肾活血 中医药 证候 差异基因 生物信息 

摘      要：研究背景及目的:冠心病是导致心血管死亡的首要原因,其病理基础体现为动脉的粥样硬化及狭窄,是临床常见病和多发病,在我国乃至全球都已经是亟待解决的重大公共卫生问题,亟需开展更多层面的防治研究。不稳定型心绞痛因斑块极易破裂出血,往往预后凶险,虽然现有的二级预防理念以及介入治疗、冠状动脉旁路移植术等治疗手段初见成效,但仍有部分患者在血运重建后再发心绞痛,生活质量有所下降,对抗板药产生抵抗,继发性形成血栓,并发焦虑抑郁等症状,这些仍是需要解决的临床难题。中医药干预冠心病具有其特有的优势,患者的症状体征可以被改善、斑块进展得以延缓、生活质量往往也可以得到提高,然而目前尚缺乏证据等级高、指南强推荐的循证证据,而且其多系统、多机制、多靶点的多维度交互作用机制也尚不明确。现代医学研究发现,冠心病与慢性肾脏疾病具有相关性,许多慢性肾脏疾病的常见指标是冠心病发生发展的独立危险因素,控制肾脏疾病的进展或成为防治冠心病的新思路。中西医结合方法防治冠心病具有肯定的疗效,冠心病属于中医学理论中的“胸痹、“心痛范畴,中医心肾生理相关、病理相联,随着社会生活方式的改变,冠心病的中医证候不仅呈现出血瘀证,“肾虚血瘀证的组合形式占比逐渐增大,成为冠心病形成过程中重要的证候要素组合,但冠心病不稳定型心绞痛肾虚血瘀证差异分子的筛选和验证研究尚缺乏。本研究旨在围绕冠心病不稳定型心绞痛这一关键疾病发展阶段,从肾虚血瘀证入手,开展临床文献研究和生物学基础实验。临床文献研究旨在定量分析补肾活血法治疗冠心病的临床疗效,生物学基础实验旨在探索冠心病不稳定型心绞痛肾虚血瘀证患者的差异基因表达谱,并对其进行验证,以期提升冠心病的中医药防治水平,为探索冠心病肾虚血瘀证作用靶点提供客观科学依据。研究方法:1 基于文献的补肾活血法治疗冠心病有效性的荟萃分析计算机检索美国医学文摘数据库(Medline)、考克兰对照试验中心注册数据库(Cochrane Central Register of Controlled Trials)、中国知网(CNKI)、万方数据库(WanFang Data)、中国科技期刊全文数据库(VIP)、中国生物医学文献服务系统(SinoMed)从建库至2021年3月之间的文献,根据纳排标准,纳入运用补肾活血法治疗冠心病心绞痛的随机对照试验,进行信息筛选及提取,评估偏倚风险并进行荟萃分析。2 基于实验的冠心病肾虚血瘀证的差异基因筛选及验证招募对象为冠心病不稳定心绞痛(unstable angina,UA)受试者及健康受试者,所有受试者均就诊于中国中医科学院广安门医院心血管科门诊及病房,招募期限在2019年12月至2021年12月期间。最终纳入UA肾虚血瘀证组20例、UA非肾虚血瘀证组20例,健康对照组20例。其中每组中5例标本使用高通量测序技术,检测受试者外周血有核细胞中miRNA和mRNA表达情况,筛选出差异基因表达谱,根据miRNA、mRNA的调控关系构建网络,对其进行功能富集分析。每组剩余15例标本用于对基因调控网络中的关键节点进行酶联免疫吸附剂测定ELISA及定量PCR验证。研究结果:1 补肾活血法治疗冠心病的有效性荟萃分析最终纳入定性分析的文献数为10篇,总共901例冠心病患者,荟萃分析结果显示,配合补肾活血方治疗组的有效率明显高于对照组[OR=3.74,95%CI(2.65,5.29)]。配合补肾活血方治疗组的心绞痛发作频率低于对照组[SMD=-1.25,95%CI(-1.79,-0.71)],持续时间短于对照组[OR=-1.37,95%CI(-1.92,-0.81)],但结果的异质性较高。补肾活血汤组患者的低密度脂蛋白水平降低[SMD=-0.75,95%CI(-1.07,-0.42)],胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白水平无明显改变且结果异质性较大。2 冠心病肾虚血瘀证的差异miRNA-mRNA筛选及验证经筛选后,冠心病肾虚血瘀证相关差异基因共包括77个miRNA和331个mRNA,其中miRNA有47个下调、30个上调,mRNA有92个下调、239个上调。符合miRNA-mRNA共调控网络条件的共有18个miRNA和59个mRNA,其中miRNA有9个下调、9个上调,mRNA有16个下调、43个上调,包括63个基因间调控关系。使用GO富集分析冠心病肾虚血瘀证组差异表达的mRNA,结果显示差异下调的mRNA涉及到的GO项目包括43个生物学过程(Biological Process,BP)和 49 个细胞组分(Cellular Component,CC)以及42个分子功能(Molecular Function,MF),主要显著表达在凋亡细胞识别、细胞迁移的负调控、信号模式识别受体活性等。使用KEGG富集分析冠心病肾虚血瘀证组的差异表达分子,结果显示共有包括补