艾灸干预粪菌移植供体对其受体溃疡性结肠炎小鼠的疗效影响
作者单位：北京中医药大学
学位级别：硕士
导师姓名：邬继红
授予年度：2022年
学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学]
摘 要：研究目的研究显示,粪菌移植(Fecalmicrobiotatransplantation,FMT)的疗效与供体肠道菌群结构有关。供体菌群的高多样性和Ruminococcaceae,Lachnospiraceae,Clostridium clustersⅣ,等细菌的高相对丰度与溃疡性结肠炎患者接受粪菌移植后出现更好的治疗效果存在关联。艾灸不仅能够用于多种疾病的治疗,而且常常对健康人群可以起到保健和预防疾病的效果。其作用机制与调节和改善肠道菌群结构,调整有益菌与致病菌的比例,恢复肠道菌群多样性有关。本实验拟通过分析艾灸“天枢“足三里对正常小鼠的影响,以及由其产生的供体菌群对葡聚糖硫酸钠(Dextran Sulfate Sodium,DSS)诱导的实验性溃疡性结肠炎小鼠的影响,研究艾灸是否能够使供体朝向疗效更佳的方向转变,为临床粪菌移植中供体的改良提供新的思路。研究方法本实验共使用106只8周龄雄性SPF级C57BL/6N小鼠。1.造模及干预方法造模方法:2%DSS自由饮用7天用于急性肠炎模型。2%DSS自由饮用7天+正常饮水/灌肠7天+正常饮水7天(合计21天)用于粪菌移植疗效观察。艾灸干预:每日于双侧“天枢“足三里穴给予温和灸,10分钟/次/天,共7天。灌肠方法:小鼠每日于禁食8小时后接受灌肠处置。2.分组本实验共使用106只8周龄雄性SPF级C57BL/6N小鼠随机分为对照供体组(即饮水组)(20只)、艾灸供体组(20只)、7天DSS组(8只)、饮水+生理盐水组(12)、DSS+生理盐水组(12)、DSS+对照供体组(19)、DSS+艾灸供体组(15)。3.菌群分析16SrDNA菌群测序法评估各组小鼠结肠菌群群落结构。4.疗效观察利用HE染色法观察小鼠结肠组织病理学改变,评估远端结肠中肥大隐窝的数量;免疫荧光染色法评估局部炎症反应和增殖表达。研究结果1.艾灸“天枢“足三里对供体小鼠的影响温和灸“天枢“足三里7天未对小鼠体重及结肠组织产生明显影响。16SrDNA测序表明,艾灸没有改变正常小鼠群落丰富度及多样性指数,但艾灸组小鼠独有的物种数目增多,群落结构出现变化;线性判别分析发现,艾灸显著增加了小鼠结肠细菌Clostridiales,Clostridia,CoriobacteriaceaeCG02,RuminococcaceaeK4A214roup,RuminococcaceaeCG13,Actinobacteria,uminococcaceaeCG05的相对丰度。2.接受艾灸供体粪菌移植对DSS诱导的实验性溃疡性结肠炎小鼠的影响饮用DSS 7天造成小鼠体重丢失、结肠缩短,结肠黏膜层隐窝结构消失、MPO 阳性细胞增多;16SrDNA测序结果表明,7天DSS小鼠结肠菌群独有物种减少,群落丰富度及多样性指数均显著下降,群落结构出现变化,DSS使得门水平Firmicutes,Deffribacteres,Proteobacteria及其分类下的物种增加。在21天实验周期内,DSS小鼠均体重减轻、生存率下降。相对于DSS+生理盐水组与DSS+对照供体组,DSS+艾灸供体组生存率提高,体重更早恢复。与饮水+生理盐水组相比,3组DSS小鼠结肠长度均缩短,结肠重量与体重比值增加,结肠远心端黏膜组织再生形成肥大隐窝。组间比较显示,3组DSS小鼠的上述指标均无明显改善。撤去DSS 14天后,小鼠结肠黏膜层仍可观察到大量MPO阳性细胞。其中,DSS+艾灸供体组结肠中段与近心段黏膜层MPO表达明显下降;DSS+生理盐水组和DSS+对照供体组的结肠黏膜MPO表达无明显改变。此外,DSS+生理盐水组远心段隐窝中的Ki67阳性细胞数量较饮水+生理盐水组显著增加,接受粪菌移植的两组与饮水+生理盐水组无明显差异。在16SrDNA测序结果发现,饮水+生理盐水组独有OTU数目为39,DSS+生理盐水组为21;DSS+对照供体组为36;DSS+艾灸供体组为38;alpha多样性指数表明,组间群落丰富度及多样性均无显著性差异;beta多样性分析表明,3组DSS小鼠群落仍与饮水+生理盐水组有明显区别,相对于其他两组,DSS+艾灸供体组与饮水+生理盐水组最为接近,且有部分重合,说明该两组群落结构更为相似。线性判别分析发现,不同干预使得各组物种的丰度存在差异,饮水+生理盐水组主要以c-Flavobacteriia,f-Bacteroides-S24-7-group分类下的物种为主,DSS+生理盐水组以f-Bacteroidaceae,f-Porphyromonadaceae为主,DSS+对照供体组以c-Negativicues,c-Erysipelotrichia,f-Peptosttreptococcaceae,f-Clostridiaceae 为主,DS
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