PCOS患者颗粒细胞中H3K9me3的变化及其调控PCOS相关基因表达的研究

作     者：林芳旭 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郭艺红

授予年度：2022年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：多囊卵巢综合征 H3K9me3 组蛋白修饰 表观遗传学 颗粒细胞 

摘      要：多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是女性不孕的主要病因之一。PCOS是一种多因素、复杂的异质性疾病,严重影响育龄期妇女的身心健康。但目前PCOS本身的确切病因仍不清楚。许多研究表明,表观遗传变化是导致PCOS发病的潜在机制。组蛋白甲基化修饰作为一种重要的表观遗传修饰,在早期胚胎发育过程中起到了非常关键的作用。而这种表观遗传修饰变化在PCOS发病机制中的作用未被阐明。已有研究表明,H3K9me1、H3K9me2在PCOS患者中的表达存在差异,H3K9me3在调控哺乳动物卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,但H3K9me3在PCOS中的变化及其调控机制鲜有报道。因此,探索PCOS患者H3K9me3修饰的变化,探究H3K9me3与PCOS发生发展的关系,解析表观遗传修饰调控PCOS的可能机制,可为PCOS的临床诊疗提供新的思路。目的本研究通过检测PCOS组和对照组颗粒细胞(GCs)中H3K9me3修饰及其甲基转移酶和去甲基化酶的表达水平,探讨H3K9me3在PCOS组GCs中的表达差异;比较两组GCs中H3K9me3处的基因表达水平,探讨PCOS发生发展过程中H3K9me3修饰可能参与调控的基因。方法1.收集PCOS组和正常对照组GCs各20例。2.采用Western-Blot技术检测各组GCs中H3K9me3修饰的水平;采用Real-time qPCR技术检测各组H3K9me3甲基转移酶和去甲基化酶的表达,探讨H3K9me3在各组GCs中的表达特点和差异。3.通过CUT&Tag测序技术检测两组GCs中基因组的H3K9me3修饰状态,探讨两组GCs中基因组H3K9me3修饰模式与差异。4.通过UMI mRNA测序技术检测两组GCs中的差异基因,并联合CUT&Tag结果分析H3K9me3修饰模式与基因表达水平的相关性。结果1.H3K9me3修饰在GCs中的水平:①H3K9me3在PCOS组GCs中相对蛋白表达量(2.26±0.63 vs 1.70±0.32,P=0.275)与对照组相比没有显著的统计学差异;②PCOS 组 GCs 中 H3K9me3 甲基转移酶 SUV39H1、SUV39H2、EHMT1、SETDB1 的 mRNA表达量显著高于对照组(SUV39H1:2.19±0.87 vs 1.11±0.15,P=0.004;SUV39H2:1.66±0.74 vs 1.00±0.01,P=0.001;EHMT1:1.83±1.01 vs 1.10±0.30,P=0.175;SETDB1:1.79±0.64 vs 1.02±0.03,P=0.025)。而 H3K9me3去甲基化酶KDM4D、KDM4A、KDM4B的mRNA表达量显著低于对照组(KDM4D:0.48±0.32 vs 1.03±0.04,P=0.002;KDM4A:0.71±0.21 vs 1.02±0.04,P=0.001;KDM4B:0.66±0.17vs 1.01±0.01,P=0.002)。2.CUT&Tag测序分析:①两组的peak具有显著统计学差异;②PCOS组中reads相对TSS位置和全基因组的分布密度比对照组更密集;③PCOS组中peak比对照组更多分布在启动子区域;④GO功能富集显示:PCOS组和对照组患者GCs中H3K9me3处差异peak主要富集在细胞生物过程和代谢。⑤差异peak的相关基因行KGEE通路富集显示主要在代谢过程。3.UMI mRNA测序分析:①PCOS组与正常对照组有1 1 183个相同基因,PCOS组有891个差异基因,对照组有292个差异基因,其中有436个基因存在显著差异(P0.05),48个基因上调,388个基因下调;②GO功能富集显示:PCOS组与对照组GCs中差异表达的mRNA相应靶基因主要参与调控肽和肽激素以及炎症过程;③KEGG通路富集显示:差异基因主要参与糖代谢、胰岛素抵抗;④UMI mRNA测序与CUT&Tag测序均有差异表达的基因主要参与细胞生物调节、基因表达等多个生物过程。4.对部分差异基因进行H3K9me3处peak比对发现:PCOS组KCNQ1、STAT3峰值略低,DENND4C峰值略高。收集PCOS组与正常对照组GCs,对具有显著差异表达的基因进行RT-qPCR检测,结果发现PCOS组KCNQ1、STAT3显著上调(KCNQ1:3.63±2.37 vs 1.13±0.13,P=0.004;STAT3:2.21 ±0.96 vs 1.02±0.05,P=0.004),DENND4C 显著下调(DENND4C:0.55±0.38 vs 1.93±1.14,P=0.002)。结论1.PCOS组颗粒细胞中H3K9me3修饰总体水平有增加趋势;2.差异性表达基因的启动子区域H3K9me3水平增加,H3K9me3参与调控PCOS差异基因的表达;3.从表观遗传角度提示了 PCOS发生过程中与代谢和胰岛素抵抗相关。