拟南芥圆形种子突变体分析和突变基因克隆

作     者：朱芮 

作者单位：华中农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李靖

授予年度：2018年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：种子大小、形状 圆种子 图位克隆 多胚 Katanin 极性 

摘      要：种子大小形状是农作物重要的农艺性状,粒大饱满的种子是农业育种和生产的努力方向。从拟南芥这一模式生物入手,探索种子大小形状的调控机理,进行深入的研究具有重要的意义。本课题采用正向遗传学方法,从两个圆种子突变体材料er5(EMS诱变材料)、lip1(T-DNA插入材料,但T-DNA丢失)出发,利用图位克隆技术结合高通量测序的方法克隆突变基因。另外从整体水平、细胞学水平以及分子水平分析突变体表型,并结合表型对突变基因进行一些基本的功能分析,试图探究种子形状调控相关机理和植物细胞中的极性伸长问题。主要取得如下结果:1.两个纯合突变体都具有比较一致的表型。纯合突变体植物体各组织器官都显示出横向变宽,纵向变短的表型,具体为叶圆,叶柄短且粗,茎粗且脆,果荚短且粗等。er5杂合突变体植株体现类似但较弱的表型,为半显性遗传,而lip1杂合植株与野生型植株类似,为典型的隐性遗传。***5,lip1突变基因克隆。通过图位克隆结合下代测序,两个突变基因都被克隆,突变位点都位于AT1G80350基因上,该基因编码微管切割蛋白Katanin p60。不同的是er5为点突变,位于最后一个外显子倒数第5个碱基(C to T),造成p60蛋白C末端倒数第二个氨基酸由丝氨酸突变为苯丙氨酸(S to F)。lip1可能是因为T-DNA插入引起重组的原因造成p60基因在第六个外显子与第六个内含子交界处缺失43个碱基。3.突变体细胞学表型及机理探索。er5和lip1纯合突变体各器官表型经细胞生物学分析表明都是由体细胞极性伸长受阻引起。自然条件下,育性非常差,产生极少量种子,人工授粉可部分恢复育性产生较多种子。突变体种子为圆形,且体现母性效应。通过DIC显微镜观察,纯合圆种子的胚和胚柄细胞的极性伸长也受阻,发育异常,并且存在具有多个胚的种子。为进一步探究多胚产生的时期和原因,已将大孢子母细胞(MMC)、卵细胞、助细胞、中心细胞的特异性标记和不同种激素报告系统引入突变体。这些材料将为进一步观察突变体雌配子体发育的过程,各细胞形态、位置、数量以及细胞命运的变化,从而为回答雌配子体发育过程中细胞极性或激素的极性分布对其发育的影响,植物胚胎发生等生物学问题提供了材料基础。