针刺调控自噬流拮抗大鼠缺血性脑损伤的实验研究

作     者：刘芙蓉 

作者单位：南京中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：倪光夏

授予年度：2022年

学科分类：1005[医学-中医学] 100512[医学-针灸推拿学] 10[医学] 

主      题：缺血性脑损伤 针刺 自噬流 Beclin1 微管相关蛋白1轻链3 SQSTM1/p62 

摘      要：目的:观察针刺对缺血性脑损伤大鼠神经行为学评分、脑梗死体积及自噬相关指标表达的影响,明确针刺拮抗大鼠缺血性脑损伤的效应并探讨针刺调控自噬流的机制。方法:本实验主要分为实验一、实验二两大部分。实验一:针刺拮抗大鼠缺血性脑损伤的效应研究运用改良的线栓法来制备大鼠的大脑中动脉栓塞(MCAO)模型。以“醒脑开窍针刺法为介入手段。将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组,每组根据缺血时间不同分为3 h、6 h、12 h和24 h不同时点的亚组,根据缺血时间不同,在造模后相应时间点观察针刺对各组大鼠神经行为学评分、脑梗死体积的影响。实验二:针刺调控自噬流拮抗大鼠缺血性脑损伤的机制研究本部分实验的模型制备过程、针刺方法均同实验一。实验二与实验一的动物分组不完全相同,本实验在实验一的基础上,将SD大鼠随机分为假手术组、模型组、针刺组,模型组、针刺组根据缺血时间不同分为3 h、6 h、12 h和24 h不同时点的亚组,假手术组均在造模后24 h取材,其余各组根据缺血时间不同,在造模后相应时间点进行取材。运用Western blot和Real-time PCR法分别检测各组大鼠大脑皮层缺血区自噬相关指标(Beclin1、微管相关蛋白1轻链3 LC3、SQSTM1/p62)的蛋白及mRNA的表达。结果:1.各组大鼠神经行为学评分比较根据缺血时间不同,在造模后相应时间点进行评分。与假手术组相比,其余各组大鼠的神经行为学评分升高(P0.05);与同时间点的模型组比较,针刺6h、12 h、24 h组大鼠神经行为学评分均降低(P0.05)。4.各组大鼠大脑皮层中Beclin1、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及p62蛋白表达的比较与模型3 h组比较,针刺3 h组的p62表达有所下降(P0.05);与模型6 h、12 h组比较,针刺6 h、12 h组的Beclin1水平及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值下调,p62表达则上调(P0.05)。5.各组大鼠大脑皮层Beclin1、LCB及p62的mRNA表达比较与假手术组比较,模型组4个亚组中大鼠脑组织Beclin1、LC3B的mRNA水平升高,模型6h、12h、24h组中p62mRNA表达水平降低(P0.05);与本组3 h比较,模型6h组的Beclin1、LC3B水平都升高,p62表达有所下降(P0.01);与模型6 h组比较,模型12 h组的Beclin1、LC3B水平降低,p62表达有所升高(P0.05);与模型3h组比较,针刺3h组的p62的mRNA表达下降(P0.01),Beclin1、LC3B水平降低(P0.05);与模型6h、12h、24h组比较,针刺6h、12h、24h组的Beclin1及LC3B的mRNA下调,p62表达则上调(P0.05)。结论:1.大鼠脑缺血后,自噬被激活,在缺血3h时呈上调趋势,缺血6h时自噬水平达到最高,12h开始逐步下调,在缺血24h时仍维持在较高水平,呈动态变化规律,表明自噬流是动态过程。2.脑缺血2h时针刺介入,能有效改善脑缺血大鼠神经功能、减小脑梗死体积,具有拮抗缺血性脑损伤的效应。3.针刺拮抗损伤的效应可能是通过调控大鼠缺血脑组织中Beclin1、LC3及p62蛋白和mRNA的表达,进而调控自噬流来实现的。脑缺血3 h时,针刺效应表现为促进自噬;从缺血6h至24h内,针刺效应表现为下调自噬,在缺血6 h时下调最为明显。