杨树种毛及花发育相关基因的分析及基因编辑

作     者：钟姗辰 

作者单位：中国林业科学研究院 

学位级别：硕士

导师姓名：张冰玉

授予年度：2021年

学科分类：0907[农学-林学] 08[工学] 0829[工学-林业工程] 09[农学] 

主      题：欧美杨‘渤丰3号’ 银腺杨‘84K’ 种毛 花粉 PeCFL1/PeCFL2/PagAG2 

摘      要：杨属(Populus L.)植物生长迅速、遗传转化体系成熟、基因组相对较小并已完成基因组测序,具有优良的实验特性,是木本植物的模式树种。另外,杨树因其生长速率快、抗病能力强、绿化效果明显,在众多可供选择的绿化植物中也具有突出的价值。而近年来杨树飞絮(种毛)及花粉已成为困扰我国北方城市的一大难题,在人口稠密的地区造成了较严重的城市健康问题,是春季人体重要的致敏源。本研究将前期工作中筛选出的2个杨树种子发育不同时期差异性表达的基因(Pe CFL1和Pe CFL2,基因注释表明与棉纤维发育相关),以及1个在杨树雄花花发育过程中差异性表达的基因(PagAG2),分别作为杨树种毛候选基因及杨树雄花花粉发育关键调控基因,通过石蜡切片、实时定量PCR、原位杂交、基因编辑等技术手段对候选基因进行功能分析,并获得了相应基因编辑植株。之后对基因编辑植株的脱靶效应及编辑基因的部分上下游基因表达量等进行了分析。论文主要研究结果如下:(1)利用石蜡切片技术,观察杨树雌花种毛的形态发生及雄花花发育。结果显示欧美杨‘渤丰3号’(Populus×euramericana‘Bofeng 3’)雌花花枝水培第12天后,子房胎座底部出现纤维状结构,杨絮开始形成;而在银腺杨‘84K’(Populus alba×***‘84K’)雄花发育过程中,花药逐渐成熟形成两室花药,花药开裂后花粉随即释放。(2)利用生物信息学方法对Pe CFL1和Pe CFL2蛋白质理化性质、立体结构等进行预测分析。预测结果显示二者应为亲水性跨膜蛋白,并且含有信号肽的可能性较小,定位于线粒体内膜、质膜、高尔基体等细胞结构可能性较大。(3)利用实时定量PCR、原位杂交进行基因的时空表达分析。Pe CFL1和Pe CFL2在欧美杨‘渤丰3号’的根、茎、叶及雌花花枝腋芽中有微量表达,在水培第4天至第7天雌花花序中少量表达,水培第8天后表达量开始显著升高,Pe CFL1和Pe CFL2在第12天子房胎座底部纤维状结构形成时表达量继续大幅上升,并且二者在胎座底部纤维状结构及子房壁中特异性表达;而PagAG2的表达量在雄花花发育时期先增加后降低,第6天即花粉囊开裂、花粉散出前达到顶峰,至第7天表达量回落,并且在银腺杨‘84K’组培苗根、茎、叶中也能够检测到该转录物;原位杂交结果显示PagAG2在银腺杨‘84K’雄花花药中表达但在包围花药的周围组织中不表达。(4)Pe CFL1、Pe CFL2及PagAG2基因编辑及分子检测。构建了Pe CFL1、Pe CFL2、PagAG2的CRISPR/Cas9基因编辑载体p YLCRISPR/Cas9-DH-Pe CFL1、p YLCRISPR/Cas9-DH-Pe CFL2和p YLCRISPR/Cas9-DH-PagAG2,利用农杆菌介导的遗传转化技术转化欧美杨‘渤丰3号’及银腺杨‘84K’,分别获得Pe CFL1、Pe CFL2、PagAG2潮霉素抗性植株1株、8株、54株。经PCR及Sanger测序检验,未获得Pe CFL1、Pe CFL2基因编辑株系,获得纯合PagAG2基因编辑植株1株,且暂未发现脱靶现象。PagAG2基因编辑植株中,靶标基因在根、茎、叶中的表达量较野生型低,且同期生长量高于野生型。另外,对该基因的编辑影响了下游基因(STK1、STK2、SPL16、SPL25)的表达量,而对可能产生拮抗作用的上游基因AP2影响相对较小。