坛紫菜胰脂肪酶抑制肽制备及其作用机理研究

作     者：冷檬 

作者单位：集美大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孙乐常;林雄水

授予年度：2022年

学科分类：0832[工学-食品科学与工程（可授工学、农学学位）] 08[工学] 083204[工学-水产品加工及贮藏工程] 

主      题：坛紫菜 高脂血症 胰脂肪酶 分离纯化 胰脂肪酶抑制肽 

摘      要：高脂血症(hyperlipoidemia)是指由于代谢异常使血浆中的一种或多种脂质异常升高而导致的疾病,高脂血症及其并发症如心血管疾病的发病率和死亡率逐年递增。胰脂肪酶(Pancreatic lipase,PL)是胰腺分泌的主要脂肪酶,直接影响肠道对脂肪酸的吸收,抑制胰脂肪酶催化活性是治疗高脂血症的重要手段之一。本研究利用鲍鱼内脏酶对坛紫菜进行破壁,提取制备紫菜蛋白,并利用纳豆芽孢杆菌进行发酵,提取制备发酵液中具有胰脂肪酶抑制活性的蛋白肽,对其进行分离纯化,研究抑制肽对胰脂肪酶的抑制机理。以皱纹盘鲍内脏(Haliotis discus hannai)为原料,使用蒸馏水浸提的方法提取制备鲍鱼内脏酶,并通过单因素和响应面法优化鲍鱼内脏酶酶解坛紫菜(Porphyra haitanensis)工艺。结果表明,酶解的最佳条件为:加酶量7.6%、酶解时间2.8 h、酶解温度35℃、料液比1:25,所得蛋白得率为238.65±2.13 mg/g,鲍鱼内脏酶酶解所得蛋白得率显著高于反复冻融法、超声破碎法、溶胀法等传统破壁方法(P0.01)。研究不同干燥方式对紫菜蛋白的功能性质的影响,结果表明冷冻干燥紫菜蛋白(Freeze-dried Porphyra haitanensis protein,FPP)具有更加优良的溶解度和乳化性能,而喷雾干燥紫菜蛋白(Spray-dried Porphyra haitanensis protein,SPP)表面疏水性和接触角大小高于FPP,且在溶液pH 3～11范围内趋势变化均表现一致。对FPP和SPP微观结构进行观察,扫描电镜图片显示,FPP呈形状和大小不一、表面光滑的片状结构;SPP呈大小较为均一、表面有凹槽的球状颗粒结构。在此基础上,以冷冻干燥的紫菜蛋白为氮源配置发酵培养基,并接种纳豆芽孢杆菌发酵,优化发酵条件,在接种量为7%、pH为7.0、发酵时间为24 h时,发酵液具有最高的胰脂肪酶抑制活性,分子量分布比例测定结果显示发酵液1 k Da以下组分占比超过90%。通过3 k Da超滤、Superdex Peptide 10/300 GL和ZORBAX Eclipse Plus C18对发酵液进行分离纯化,经质谱鉴定、在线活性预测和分子对接模拟后,得到两个脂肪酶抑制肽TPPGP和NAPPP。体外活性测定结果显示TPPGP和NAPPP对胰脂肪酶的半数抑制浓度(IC)分别为329.5μmol/L和529.8μmol/L。拟胃肠液消化结果表明TPPGP和NAPPP均有较好的耐消化稳定性。进一步探究了胰脂肪酶抑制肽的作用机制。差示扫描荧光(Differential scanning fluorometry,DSF)测定结果显示,1 mmol/L的TPPGP和NAPPP分别可使胰脂肪酶的熔解温度(T)提高6.87℃和5.19℃。抑制动力学结果表明TPPGP对胰脂肪酶的抑制类型为竞争/非竞争性混合型抑制,NAPPP对胰脂肪酶的抑制类型为竞争性抑制。分子对接模拟结果显示抑制肽主要用过氢键、范德华力、Alkyl和π键与胰脂肪酶结合,两个抑制肽均可以与胰脂肪酶的活性催化三联体(Ser 152、Asp 176和His 263)和疏水盖结构域(Gly77、Lys 80、Leu 213和Met 217)的活性位点形成氢键。本研究为坛紫菜蛋白的高效提取和在工业加工中的应用提供理论参考,同时为紫菜来源的功能性食品开发提供了思路和技术支持。