三联活菌通过GPR43抑制肿瘤细胞糖酵解缓解小鼠炎症相关结直肠癌

作     者：卢霞 

作者单位：南京大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王婷婷

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：益生菌 炎症相关结直肠癌 肠道菌群 糖酵解 GPR43 

摘      要：背景:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤之一。在我国,其死亡率居恶性肿瘤死亡率的第五位。炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD),包括克罗恩病(Crohn’s disease,CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC),IBD患者较健康人群更易发生肠癌,由IBD发展而来的结直肠癌称为炎症相关结直肠癌(colitis-associated colon cancer,CAC)。与健康个体比,CRC患者的肠道菌群呈现出生态失调的现象,肠道菌群和CRC的发生密切相关,很多研究表明调节肠道菌群可以降低CRC的风险。益生菌是一类对宿主健康有益的活性微生物,大量研究表明,益生菌在抗肿瘤、调节机体免疫和优化肠道微生态环境中发挥重要作用。目前,大部分对于益生菌的研究多聚焦于单一菌株,复合菌株联合抗肿瘤的作用研究甚少。因此,本研究采用三种菌株嗜酸乳杆菌、保加利亚杆菌、枯草芽孢杆菌以1:1:1的比例联合发酵制备而成的三联活菌,分别取三种细菌拉丁文的首字母组成三联活菌的名称缩写BAS,本研究旨在探索该三联活菌的抗肿瘤作用及其分子机制,以期为CRC的治疗提供新思路。目的:(1)明确三联活菌相比于单一菌株在益生特性方面的优势;(2)明确三联活菌对小鼠结肠炎和结直肠癌的缓解作用;(3)探讨三联活菌治疗结直肠癌的分子机制。方法:1.将单一菌株和混合菌株分别接种于含有不同p H值、不同浓度牛胆盐的特定液体培养基中,37℃100 r/min培养3 h,测定其OD600,分析其对酸和胆盐的耐受性;将单一菌株和混合菌株分别加到接种有大肠杆菌的LB营养琼脂平板中,37℃培养12 h后测量抑菌圈直径,分析其对大肠杆菌的抑制作用。2.将6-8周的雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、肠炎组和BAS治疗组。用3%葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)给予小鼠自由饮水,建立结肠炎模型,BAS每隔两天灌胃给药,治疗结束后给予小鼠安乐死,评估其体重变化、疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠病理损伤、肠粘膜通透性变化;q PCR检测结肠炎性因子、紧密连接蛋白的m RNA表达情况;Western blot检测紧密连接蛋白的蛋白表达情况;16s RNA高通量测序技术检测肠道菌群变化。3.将6-8周的雌性C57BL/6J小鼠随机分为对照组、肿瘤组和BAS治疗组,用氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)和DSS建立小鼠CAC模型,在DSS处理时间内,给予BAS隔天灌胃处理,在第100天给予小鼠安乐死,评估小鼠结肠肿瘤大小、肿瘤数目及肿瘤负荷的变化;在体外,检测BAS处理对结肠癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响;在体内和体外,用q PCR、Western blot分别检测肿瘤细胞糖酵解相关酶的基因、蛋白表达情况;应用Seahorse细胞能量代谢检测仪器分析BAS对CRC细胞糖酵解、线粒体有氧代谢的影响。结果:***和单一菌株都能耐受p H值高于2.0的酸性环境,但是BAS比单一菌株生长得更快;与单一菌株相比,BAS在含有牛胆盐的特定培养基中表现出更高的生长活性;与单一菌株相比,BAS对大肠杆菌具有更强的抑菌作用。2.与肠炎模型组相比,BAS治疗后小鼠结肠炎体征明显得到改善,体重出现明显回复,DAI指数下调,组织病理学评分显著提高;肠道通透性显著提高,β-D-葡聚糖、内毒素的含量明显降低,酸性黏液物质显著增加,紧密连接蛋白表达显著上调;炎性因子分泌显著减少,抗炎因子分泌显著增加;肠道菌群失衡情况明显改善,肠道菌群物种丰度、物种均匀度显著升高,肠杆菌目、埃希氏菌属、梭菌属等共生致病菌的相对丰度明显下降,毛螺菌科、普雷沃氏菌科等丁酸产生菌的相对丰度显著升高。3.与肿瘤组相比,BAS治疗显著抑制小鼠CAC发展,降低了结肠肿瘤大小、肿瘤数目以及肿瘤负荷,肿瘤组织病理学评分显著降低,结肠炎症因子的表达显著降低。体外实验证实,BAS显著抑制结直肠癌细胞(HCT116和CT26细胞)的增殖、迁移,诱导其凋亡;BAS处理后HCT116和CT26细胞糖酵解关键酶的表达明显降低,此外,BAS处理降低了CRC细胞的葡萄糖摄取、乳酸产量和胞外酸化率(ECAR),增加了CRC细胞的耗氧率(OCR);给予CAC小鼠腹腔注射糖酵解激活剂-果糖2,6-二磷酸(FBP)后,FBP与BAS联用消除了BAS对CAC的保护性作用;BAS处理上调了GPR43的m RNA表达,但对GPR41和GPR109a的m RNA表达无明显影响,BAS处理后HCT116和CT26细胞中的Ga(i/o)、PLC和PKC表达显著增加,同时ERK的磷酸化也显著上调;进一步研究显示