红景天苷调控节律基因Bmal1抑制模拟失重大鼠脑动脉线粒体氧化应激和炎性反应

作     者：李文凡 

作者单位：中国人民解放军空军军医大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汤海峰;谢满江

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：模拟失重 红景天苷 节律紊乱 Bmal1 氧化应激 炎性反应 

摘      要：研究背景航天飞行微重力环境引起航天员发生严重的心血管功能失调,主要表现为航天员重返地面时出现的运动能力严重降低和立位耐力不良。因此,微重力环境对航天员心血管的影响机理及其对抗措施一直是目前航天医学保障的重点研究问题。但目前航天飞行中心血管功能失调仍缺乏简单、有效的对抗措施。血管炎性反应是高血压、动脉粥样硬化、糖尿病、肥胖等多种心血管疾病发生发展的共同生理/病理基础,深入研究血管炎症和航天飞行后心血管疾病的相互关系和作用机制,可为心血管疾病的治疗和预后提供新的思路和药物新靶点。线粒体氧化应激是引起血管炎性反应的一个重要因素。在线粒体中,少量电子会从呼吸链漏出,并生成活性氧(ROS)。ROS可被超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(catalase)等清除。如果ROS不能被及时清理,会导致氧化-抗氧化系统平衡的破坏,形成氧化应激损伤。近年来,心血管系统中的某些重要分子或胞内重要细胞器所表现的昼夜节律紊乱是治疗心血管疾病的一个新的研究方向。尽管在航天飞行过程中采用人工照明来模拟地面的昼夜变化以保持航天员的原有的作息规律,但其生物节律仍然发生紊乱。本实验室前期工作已经证明:(1)模拟失重改变大鼠脑动脉组织节律基因的昼夜节律特征;(2)模拟失重大鼠的心率、收缩压与舒张压等发生“似昼夜节律紊乱。这些研究结果提示,重力作为授时因子信号参与调控心血管系统的结构和功能。其中,节律基因Bmal1在保持动脉血管平滑肌的正常收缩性中具有重要的意义。红景天(Rhodioal rosea L)是一种高海拔地区生长的景天科植物,最早作为药品记载于《四部医典》。《本草纲目》中记为“景天,上品、甘涩、寒、无毒、治肺病。红景天主要生长在海拔4500米左右的河滩沙地、砂质草地以及石头缝中。《中华人民共和国药典》中记载其功能主要为益气活血,通脉平喘;主治用于气虚血瘀,胸痹心痛,中风偏瘫,倦怠气喘。红景天苷作为红景天的主要有效成分之一。现代研究证明,红景天苷具有抗疲劳、抗衰老、免疫调节、清除自由基等多种药理作用,不但可提高脑血液流变学和增加能量代谢等中枢神经系统保护作用,而且还具有提高心肌收缩力、减轻心率失常、舒张血管等心血管保护作用。但红景天苷在失重环境中能否发挥脑动脉血管保护作用、发挥动脉血管保护作用的具体机制、以及红景天苷对节律紊乱的保护作用未见报道,因此本项工作主要探讨红景天苷能否减轻模拟失重大鼠脑动脉炎性反应,改善模拟失重大鼠的昼夜节律紊乱,并探讨其中的分子机制。研究目的1)红景天苷能否减轻模拟失重引起的大鼠脑动脉线粒体氧化应激和炎性反应。2)红景天苷能否改善模拟失重引起的大鼠脑动脉节律基因Bmal1表达紊乱。3)节律基因Bmal1在红景天苷减轻模拟失重大鼠脑血管氧化应激和炎性反应中的作用。研究方法1)免疫印迹实验:取大鼠脑动脉或A7r5细胞蛋白进行蛋白表达的分析。2)逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应实验:取大鼠脑动脉或A7r5细胞并行实时荧光定量PCR实验,检测其m RNA的表达水平。3)大鼠脑动脉血管平滑肌细胞的急性分离:剥离大鼠脑动脉并剪成血管段,加入酶消化液消化脑动脉组织,收集脑动脉血管平滑肌细胞。4)透射电子显微镜观察:观察大鼠脑动脉平滑肌细胞的线粒体形态。5)Mito SOX、Rhod-2、Fluo-4染色:急性分离大鼠脑动脉,在培养基中加入Mito SOX、Rhod-2、Fluo-4荧光染料,根据荧光强度分析线粒体内ROS、线粒体内Ca2+、胞浆Ca2+含量。6)细胞转染:通过Lipofectamine 3000将目标si RNA转染至细胞中。7)双荧光素酶报告基因实验:构建双荧光素酶报告基因质粒,转染双荧光素酶报告基因质粒至A7r5细胞,检测荧光强度。8)免疫荧光染色:对大鼠脑动脉进行石蜡切片后,进行脱蜡、封闭、孵育一抗、孵育带有荧光标记的二抗、DAPI复染、封片后,进行拍照并计算结果。9)流式细胞术:将A7r5细胞染色后,重悬并调整细胞个数至合适,检测荧光强度。10)ELISA检测:提取相应A7r5细胞上清,按照说明书进行操作并测定OD值。11)ADP/ATP检测:取匀浆处理好的大鼠脑动脉组织上清液和A7r5细胞悬液,测定OD值。12)NAD+/NADH检测:取裂解后的大鼠脑动脉组织上清液和A7r5细胞上清液,测定OD值。13)Transwell共培养实验:将A7r5细胞接种于Transwell皿的底部,巨噬细胞接种于小室中共培养,拍照并检测巨噬细胞的数量。14)细胞增殖检测(CCK-8实验):接种A7r5细胞并加入CCK-8溶液,使用酶标仪测定OD值,绘制细胞增殖曲线。15)数据分析与统计:实验结果均以均值±标准误(means±SEM)表示。使用软件进行实验数据的统计学分析及统计图制作。其中两组值之间的比