菊苣酸缓解LPS诱导的奶牛蹄叶角质细胞炎性损伤的作用机制研究

作     者：齐冬冬 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张建涛

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：奶牛 肢蹄病 蹄叶炎 角质细胞 菊苣酸 

摘      要：蹄叶炎是奶牛场临床实践中常见的肢蹄病之一,可引发严重跛行,降低奶牛泌乳量和生产性能,造成较大经济损失。蹄叶炎发病时,蹄叶组织表皮层的角质细胞出现炎性损伤和角蛋白合成障碍,产生蹄壳角化不良、蹄裂、蹄底溃疡等临床症状。菊苣酸是紫锥菊等天然植物的活性成分,具有抗炎和提高免疫力等多种药理活性。目前对奶牛蹄叶炎的研究仅局限于实验动物层面,还没有从细胞水平研究奶牛蹄叶炎的报道。据此,本研究首次开展奶牛蹄叶角质细胞的分离、纯化及鉴定实验,利用脂多糖(LPS)建立蹄叶角质细胞炎性损伤体外模型,探究天然药物菊苣酸对LPS诱导的蹄叶角质细胞炎性损伤的保护作用,旨在为防治奶牛蹄叶炎提供备选药物参考及相关理论依据。本研究分为三个部分:(1)奶牛蹄叶角质细胞分离、纯化及鉴定。选用中国荷斯坦奶牛健康蹄,分离获得蹄叶组织,选择胰酶法、胶原酶法、中性蛋白酶联合胰酶法和中性蛋白酶联合胶原酶法四种消化方法,筛选出分离奶牛蹄叶角质细胞的方法,并使用免疫荧光法鉴定角质细胞的特异性角蛋白14。(2)脂多糖诱导蹄叶角质细胞炎性损伤体外模型的建立。分别使用0、5、10、20、50μg/m L浓度的LPS刺激蹄叶角质细胞24或48 h,以细胞活力和上清液内促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量筛选蹄叶角质细胞炎性损伤模型的建立条件。(3)菊苣酸对LPS诱导的蹄叶角质细胞炎性损伤保护机制的研究。分别使用30、60、120μg/m L菊苣酸预处理蹄叶角质细胞6 h,再使用10μg/m L LPS作用24 h,检测细胞活力、促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)、炎症介质(i NOS和COX-2)和趋化因子(CXCL-1和CXCL-6)的含量和基因表达量,同时检测细胞TLR4/MAPK/NF-κB信号通路中相关基因和蛋白的表达。结果显示:(1)使用中性蛋白酶联合胶原酶法分离的蹄叶角质细胞增殖速度快,子4代的细胞数目多,细胞呈角蛋白14阳性表达。(2)10μg/m L LPS刺激24 h可显著抑制蹄叶角质细胞活力(P0.05),显著增加上清液内促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的含量(P0.05);该条件适于建立蹄叶角质细胞炎性损伤模型。(3)不同浓度菊苣酸预处理均可缓解LPS诱导的蹄叶角质细胞炎性损伤,其中120μg/m L的菊苣酸预处理保护效果较好,可显著抑制蹄叶角质细胞活性降低(P0.05),抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路,下调TLR4、My D88、JNK、ERK、p38、IKKβ、p65、p50的表达(P0.05),提高IκBα的蛋白表达(P0.05),下调促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)、炎症介质(i NOS和COX-2)和趋化因子(CXCL-1和CXCL-6)的上清液含量和基因表达量(P0.05)。结果表明:(1)中性蛋白酶联合胶原酶法分离、结合差速消化法和差速贴壁法纯化,可用于奶牛蹄叶角质细胞的体外分离、纯化。(2)10μg/m L LPS刺激24 h可成功诱导蹄叶角质细胞炎性损伤。(3)120μg/m L菊苣酸预处理可以显著提升蹄叶角质细胞活力,通过抑制TLR4/MAPK/NF-κB信号通路,下调炎性因子的表达,有效减轻LPS诱导的蹄叶角质细胞炎性损伤。