水稻RSHs基因克隆及功能分析

作     者：杜丽峨 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈稷

授予年度：2019年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 09[农学] 071007[理学-遗传学] 0901[农学-作物学] 

主      题：水稻(Oryza sativa) RSHs 生物信息学分析 组织特性表达 严紧反应 

摘      要：(p)pp Gpp是GTP或GDP被进一步磷酸化后形成的小分子信号物质。在细菌受到外界胁迫时(p)pp Gpp能够有效的调节细菌的生长活动来抵御不良环境,在细菌中,(p)pp Gpp的代谢受到Rel A和Spo T的控制。目前在藻类和高等植物叶绿体中都发现了Rel A和Spo T的同系物RSHs(Rel A/Spo T homologs),同时发现RSHs与植物生长、基因表达及胁迫应答等密切相关。水稻作为重要的粮食作物,在其开花结实期,外界胁迫环境可能影响水稻的授粉与结实进而影响到水稻的产量;在其生长成熟的晚期,授粉效率和结实率对水稻的产量有决定性的作用。本研究通过克隆水稻RSHs基因家族,利用生物信息学方法分析预测其各个成员的生物学功能,并初步对其功能的进行验证,为深入开展水稻RSHs基因家族的功能研究奠定基础。(1)首先扩增水稻RSHs基因家族:Os RSH1、Os RSH2、Os RSH3、Os CRSH1、Os CRSH2、Os CRSH3,利用Interpro和Clustal Omega对水稻RSHs家族各成员的蛋白结构进行分析,用splitstree对Os RSHs进行系统进化分析,用Plant CARE对水稻RSHs在光照应答、组织特性表达和激素应答过程中存在的特异性和差异性进行系统的分析。发现水稻RSHs和拟南芥RSHs在蛋白结构和功能域上具有高度相似性。水稻RSHs启动子中具有多种与植物生长发育、光照应答和激素应答相关的顺式作用元件。(2)利用T4连接酶构建p MDC83-RSH2、p MDC83-RSH3、p MDC83-CRSH1、p MDC83-CRSH2、p MDC83-CRSH3总共5个载体,农杆菌转化烟草瞬时表达,用荧光显微镜和共聚焦显微镜确定Os RSH2蛋白定位表达于叶绿体,Os RSH3蛋白定位表达于叶绿体,Os CRSH1蛋白定位表达于叶绿体,Os CRSH2和Os CRSH3蛋白是非叶绿体定位蛋白,它们可能是定位于细胞膜的。(3)通过q RT-PCR实时监测大田种植野生型水稻各组织中RSHs基因的表达情况。组织特异性结果表明,Os RSH1、Os RSH2、Os RSH3、Os CRSH1、Os CRSH2在叶片的表达水平较高,Os CRSH3在根部特异表达,Os CRSH1和Os CRSH2在新叶的特异性表达尤其显著。Os RSH2、Os CRSH1和Os CRSH2老穗中特异性高表达,Os RSH3在雌蕊中特异性高表达,Os RSH1和Os CRSH3在外稃特异性高表达。Os RSH1和Os CRSH2在胚中特异性高表达,Os RSH2在老叶中相对表达水平较高,Os RSH2、Os CRSH1和Os CRSH2在胚乳特异性高表达。(4)非生物胁迫和激素影响Os RSHs的表达。室内培养水稻幼苗,MS液体培养基中生长10 d后,分别用50μM ABA、10μM IAA、250 m M Na Cl、叶片划伤、UV照射、黑暗、40℃、10℃处理,Os RSHs基因家族对胁迫和激素存在不同程度的应答以维持植株生长。(5)利用T4连接酶构建p ET41a-RSH1、p ET41a-RSH2、p ET41a-RSH3、p ET41a-CRSH1、p ET41a-CRSH2、p ET41a-CRSH3共6个载体,通过功能互补实验,证明Os RSH1不能恢复?rel A?spo T双突变体菌株的生长抑制,不具有Rel A-Spo T相似功能。Os RSH2、Os RSH3、Os CRSH1、Os CRSH2和Os CRSH3能恢复?rel A?spo T双突变体生长抑制,具有Rel A-Spo T相似功能,参与(p)pp Gpp的代谢。