极端嗜盐古菌蛋白NJ7G＿0991在大肠杆菌中表达对细胞外膜完整性的影响

作     者：曹蕾 

作者单位：武汉大学 

学位级别：硕士

导师姓名：唐晓峰

授予年度：2020年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：嗜盐古菌 脂蛋白 细胞形态 外膜完整性 共表达 

摘      要：NJ7G＿0991是极端嗜盐古菌Natrinema gari J7-2的一种Sec依赖性途径分泌的蛋白,其在胞外组分中有较高丰度。实验室前期通过生物信息学分析发现,该蛋白具有一个类似Lol A的结构域,而Lol A在大肠杆菌脂蛋白转运定位系统中起重要作用。前期研究发现菌株J7-2的NJ7G＿0991的Lol A结构域缺失突变株的细胞形态由杆状变成圆形。而将NJ7G＿0991在大肠杆菌中表达时,该蛋白大部分分布在培养液胞外组分中。为了研究NJ7G＿0991的Lol A结构域的功能,我们分别构建NJ7G＿0991缺失信号肽和C端结构域的两个突变体并在大肠杆菌中诱导表达后,发现NJ7G＿0991ΔC与NJ7G＿0991一样,大量表达至胞外组分中,而NJ7G＿0991ΔS积累在全细胞组分中;表达具有Lol A结构域并保留信号肽的突变体NJ7G＿0991ΔC的菌株与转入空载质粒p ET26b的菌株相比对溶菌酶耐受度明显降低,显微镜下观察到大部分细胞形态变圆,而表达无信号肽的突变体NJ7G＿0991ΔS的菌株细胞形态无明显变化。说明表达NJ7G＿0991会对细胞外膜造成损伤,Lol A结构域在其中扮演了重要角色。我们推测该蛋白可能对大肠杆菌外膜脂蛋白转运系统造成干扰,而导致外膜完整性受损,使NJ7G＿0991与周质空间的部分蛋白分布在细胞外,这意味着NJ7G＿0991的Lol A结构域也可能在嗜盐古菌的外被完整性的维持中发挥重要作用。我们依据NJ7G＿0991对大肠杆菌外膜造成有限损伤的特性,使用具有双启动子和多克隆位点的质粒p ETDuet-1构建了NJ7G＿0991与蛋白酶WF146的共表达质粒(p D16和p D61),以建立大肠杆菌中的渗漏表达系统,提升蛋白酶的胞外表达量,从而更利于对目的蛋白的收集利用。产透明圈结果显示,转入NJ7G＿0991和WF146的共表达质粒的转化子产生胞外WF146的量高于单独表达蛋白酶WF146的转化子。该渗漏表达系统有望在工业化生产等领域提高蛋白的生产效率,更便利地获取目的蛋白。并为嗜盐古菌中细胞膜完整性的维持机制提供了新的信息。