亮氨酸对小鼠C2C12细胞的成肌作用及机制研究

作     者：刘一凡 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹允考

授予年度：2022年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：Leu C2C12细胞 RPN2 β-catenin 

摘      要：骨骼肌是动物体的重要组成部分,不仅是机体运动的动力器官,也是动物体最大的新陈代谢和内分泌器官。机械性、化学性、生物性、重金属、微量元素以及衰老等多种因素都可以造成骨骼肌的损伤,影响骨骼肌的功能,严重时会导致骨骼肌萎缩,机体丧失运动能力。因此对骨骼肌损伤再生的研究十分重要,其过程是通过骨骼肌卫星细胞的增殖、迁移和分化来完成。亮氨酸(Leucine,Leu)作为必须氨基酸,在骨骼肌的发育中起重要作用,可以促进骨骼肌卫星细胞的分化,但其作用机制尚不清楚。所以选择小鼠C2C12细胞和小鼠骨骼肌损伤修复模型来研究Leu在骨骼肌损伤修复中的作用机制,为临床上骨骼肌损伤的预防和治疗提供理论基础。采用CCK8和血球计数法、免疫荧光染色、Western blot、CO-IP、ESI质谱测序、过表达和干扰等方法研究了小鼠C2C12体外增殖、分化和骨骼肌损伤修复过程中Leu的作用和作用机制,实验结果如下:(1)CCK8和血球计数法研究表明,不同浓度的Leu对C2C12细胞的增殖没有显著影响。(2)免疫荧光和Western blot结果表明,不同浓度Leu显著提高C2C12细胞的肌管融合率、MYOD、MYOG和MYH2的蛋白水平,促进C2C12细胞的分化,最佳作用浓度为2mmol/L,发挥作用的时期为分化早期(0～2 d)。(3)CO-IP和ESI质谱测序法筛选出并验证了C2C12细胞分化早期与Leu的感受器SESN2相互作用的RPN2。(4)Western blot结果表明,RPN2随着C2C12细胞的分化表达量增加,在分化第5天时表达量最高,与分化相关标志蛋白MYOD、MYOG和MYH2表达规律一致,证明RPN2可能参与小鼠C2C12细胞的分化的调节。(5)过表达RPN2时,在不同时间点,分化相关标志蛋白MYOD、MYOG和MYH2的蛋白水平均随着RPN2的过表达而显著提高;干扰RPN2时,在不同时间点,MYOD、MYOG和MYH2的蛋白水平均随着RPN2的干扰而显著下降;干扰RPN2后加入Leu,提高了MYOD、MYOG和MYH2的蛋白水平,逆转了干扰RPN2引起的结果,证明Leu可以通过RPN2促进C2C12细胞的分化。(6)过表达RPN2时,在不同时间点,p-GSK3β的蛋白水平显著降低,细胞核内β-catenin的蛋白水平显著升高;干扰RPN2时,在不同时间点,p-GSK3β的蛋白水平显著升高,细胞核内β-catenin的蛋白水平显著降低;干扰RPN2后加入Leu,p-GSK3β表达量下调,细胞核内β-catenin表达量上调,表明RPN2可以正向调节GSK3β/β-catenin信号通路的活性促进C2C12细胞的分化,且Leu的添加可以部分恢复RPN2干扰引起的C2C12细胞分化水平的下降。(7)添加Leu的C2C12细胞诱导分化48 h,RPN2和细胞核内β-catenin蛋白水平显著上调,表明小鼠C2C12细胞分化早期Leu可以上调RPN2的表达量进而激活GSK3β/β-catenin信号通路促进C2C12细胞的分化。(8)小鼠胫骨前肌损伤造模,腹腔注射补充Leu后,HE染色结果表明,损伤1 d时肌纤维大量溶解,产生大量卫星细胞;损伤3 d时,实验组骨骼肌修复速度加快,新生肌纤维更多更明显,且有部分已经修复完成;损伤7 d时,实验组损伤处形成大量肌束,基本完成修复,而对照组刚出现大量新生肌纤维,开始损伤重建,表明Leu的添加可以促进小鼠肌肉损伤修复的进程。Western blot结果表明,在1 d、3 d、7 d时,Pax7、MYOD、RPN2和细胞核内的β-catenin随着Leu的加入显著上调,表明Leu的添加可以通过β-catenin蛋白水平的上调加快骨骼肌损伤修复的进程。Leu对小鼠C2C12细胞增殖影响不明显。细胞质中Leu感受器SESN2特异性接收到Leu进入细胞内的信号后,可以在分化早期上调RPN2的表达,降低胞质内的p-GSK3β蛋白水平,抑制β-catenin的降解,高浓度β-catenin进入细胞核促进C2C12细胞的分化,加快骨骼肌损伤修复进程,且Leu作用的最佳浓度是2 mmol/L。