沙地云杉LEA基因家族鉴定及PmLEA25基因抗逆功能分析

作     者：李佳琪 

作者单位：内蒙古农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：白玉娥

授予年度：2022年

学科分类：08[工学] 0829[工学-林业工程] 

主      题：沙地云杉 PmLEA25 遗传转化 干旱胁迫 盐胁迫 

摘      要：沙地云杉(Picea mongolica)是我国特有树种,仅分布于内蒙古浑善达克沙地东部边缘,也是内蒙古三大沙地治理和干旱区城市绿化的主要树种。但沙地云杉在极端干旱和盐碱环境下还是有不适应现象,干旱、盐等非生物胁迫严重影响着沙地云杉的生长发育。胚胎发育晚期丰富蛋白(Late embryogenesis abundant protein)是植物在受到逆境胁迫时诱导合成的一类功能蛋白,与植物抗逆功能密切相关。本研究以沙地云杉为材料,通过挪威云杉全基因组和课题组前期测定的沙地云杉生长发育的转录组数据库,筛选和鉴定LEA基因家族,并对其进行命名和生物信息学分析;通过RT-qPCR技术分析非生物胁迫(干旱、盐)下沙地云杉PmLEA基因家族成员的表达量,挖掘其抗干旱、耐盐相关的关键基因,并进行基因克隆、遗传转化拟南芥(Arabidopsis),对其进行功能验证,进而为改善和提高沙地云杉抗逆性提供理论支持,同时为云杉属植物抗逆育种提供有效的基因资源。具体结果如下:1.基于HMM模型从挪威云杉全基因组和沙地云杉转录组数据库中共鉴定出49个PmLEA家族成员,根据Pfam结构域和系统进化关系将其分为8个亚家族;保守基序分析表明,沙地云杉LEA基因在同一亚家族内的基序高度保守,但不同亚家族间差异较大。2.RT-qPCR定量结果显示,在2种胁迫下发现沙地云杉LEA基因家族中高表达量基因分别为PmLEA4.2a、PmLEA23、PmLEA25、PmLEA34和PmLEA41,其他基因也受到不同程度的诱导表达。其中PmLEA25基因在干旱和盐胁迫下均连续显著上调表达,且上调倍数最低为36倍,最高为158倍,对胁迫应答最为强烈,进而确定PmLEA25基因为调控沙地云杉干旱和盐胁迫的关键候选基因。3.利用Gateway技术构建PmLEA25基因表达载体,通过花絮侵染法异源表达拟南芥,获得T3代转基因拟南芥。4.在200mM、300mM Mannitol和150mM、200mM NaCl胁迫处理下,PmLEA25基因过表达拟南芥的种子萌发率均明显高于野生型,同时过表达株系幼苗的主根长度明显要比野生型长、且侧根更多。5.在干旱和盐胁迫处理下,PmLEA25基因过表达拟南芥的成苗生长状态明显优于野生型;过表达拟南芥体内的脯氨酸含量,POD、SOD、CAT酶活力明显高于野生型,MDA含量明显低于野生型,表明PmLEA25基因提高了拟南芥对干旱和盐胁迫的耐受性。