鸭瘟病毒gC/gE双基因缺失疫苗候选株的构建及其免疫效果评价

作     者：丰鑫 

作者单位：四川农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：汪铭书;程安春;陈斌

授予年度：2022年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：鸭瘟 gC/gE基因缺失 免疫效果 

摘      要：鸭瘟病毒(Duck Plague Virus,DPV)感染可致鸭、鹅等水禽严重发病和死亡,疫苗免疫可有效预防该病的发生,但目前市售疫苗免疫鸭产生的抗体与自然感染DPV产生的抗体无法区分,以至于难以用疫苗免疫来实现对鸭瘟的净化。因此我们构建了DPV的gC/gE双基因缺失(CHv-ΔgC/gE)疫苗候选株,并对其遗传稳定性、安全性和免疫保护效果进行评价,结果如下:***-ΔgC/gE双基因缺失株构建及其遗传稳定性利用本实验室已经搭建的鸭瘟病毒细菌人工染色体(BAC),使用无痕缺失技术将实验室前期构建的g C基因缺失DPV(CHv-Δg C)的g E基因敲除,获得gC/gE双基因缺失(CHv-ΔgC/gE)病毒株,经鉴定正确。将CHv-ΔgC/gE在DEF细胞上传20代、鸭子上传5代,通过PCR鉴定及测序结果表明CHv-ΔgC/gE缺失基因区未发生回复或突变,对鸭子不致病的毒力特性不发生改变。生长曲线结果显示,CHv-ΔgC/gE与亲本病毒CHv和CHv-Δg C相比,缺失g E后的DPV增殖能力进一步下降。***-ΔgC/gE株对鸭的致病性将10、10、10TCID的CHv-ΔgC/gE肌肉注射14日龄雏鸭,观察10 d,结果显示3个滴度的双缺失株感染的鸭体温正常(40.5-42.5℃)、无死亡,体重变化趋势与空白对照组相似。感染亲本病毒CHv的鸭子体重下降,体温持续高热(43℃以上),感染后第5 d全部死亡。肉眼及光学显微镜观察鸭子脏器病理情况,结果显示,CHV-ΔgC/gE和空白对照组鸭眼观正常、没有出现组织学病变;CHv组鸭出现典型鸭瘟眼观及组织学病变。***-ΔgC/gE株的免疫效果评价(1)免疫攻毒保护:将10、10、10TCID的CHv-ΔgC/gE和市售商品鸭瘟疫苗免疫14日龄雏鸭,免疫10 d后用100 LD的DPV强毒攻击。结果显示10、10、10TCID的CHv-ΔgC/gE和鸭瘟弱毒疫苗免疫鸭子分别存活10只、6只、4只和10只,保护率分别为100%、60%、40%和100%;未免疫的对照组10只鸭子在攻毒后第5 d全部死亡。(2)免疫抗体水平:对免疫10TCID的CHv-ΔgC/gE和市售商品疫苗的鸭子血清中抗体进行检测,结果表明,(I)中和抗体:在免疫后第5 d开始检测到中和抗体,7 d和21 d时CHv-ΔgC/gE免疫鸭血清平均中和效价分别为2和2,市售鸭瘟疫苗免疫鸭血清平均中和效价分别为2和2,二者差异不显著。(II)ELISA抗体:在免疫后第3 d检测到ELISA抗体OD值与空白对照组血清OD值无显著差异,在5 d、7 d和21 d时免疫CHv-ΔgC/gE的鸭血清中ELISA抗体的平均OD值分别为0.476、0.416和0.747,市售鸭瘟疫苗免疫鸭血清ELISA抗体的平均OD值分别为0.564、0.576和0.632,二者差异不显著。(3)免疫鸭清除鸭体内感染强毒、抑制泄殖腔排毒效果:CHv-ΔgC/gE和市售商品疫苗免疫鸭能够有效清除鸭内脏器官(心、肝、脾、胸腺等)感染的DPV强毒,显著降低DPV强毒感染鸭泄殖腔排毒量。综上所述,本研究构建获得的DPV CHv株的g C和g E双基因缺失株(CHv-ΔgC/gE),其毒力大为减弱、对鸭无致病性,在DEF传20代和雏鸭传5代可保持遗传稳定;以10TCID/m L的CHv-ΔgC/gE免疫鸭1 m L,能诱导鸭产生与市售商品鸭瘟疫苗免疫相当的中和抗体及ELISA抗体水平,能够抵抗鸭100倍半数致死量DPV强毒攻击,具有良好的免疫保护效果,具备进一步发展为鸭瘟gC/gE双基因缺失、标记弱毒疫苗的潜力。