热带念珠菌和人CypD蛋白及其与CsA相互作用对比研究

作     者：乔梅兰 

作者单位：河南工业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李瑞芳;赵英源

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100103[医学-病原生物学] 10[医学] 

主      题：mPTP CypD 热带念珠菌 人肝细胞L02 CsA RACE 

摘      要：线粒体的膜通透性转换孔(membrane permeability transition pore,mPTP)是一个蛋白复合体,其开关调节着线粒体功能。mPTP的不可逆打开是各种病理条件下细胞发生功能障碍的根本原因。免疫抑制剂环孢菌素(CsA)是一个环状十一肽,能够与动物细胞的mPTP组分CypD蛋白结合,抑制mPTP打开。实验室前期实验结果表明,CsA对抗菌肽CGA-N12诱导的热带念珠菌mPTP打开无抑制作用。比较人源肝细胞L02与热带念珠菌CypD基因、蛋白结构及二者与CsA的相互作用,以期筛选热带念珠菌特异性蛋白,为特异抗念珠菌药物设计提供新靶点。本论文开展了以下几方面的研究:(1)热带念珠菌CypD基因的c DNA全长序列的克隆。本试验根据Gen Bank数据库已公布的Cyp40基因编码的人、大鼠、小鼠等CypD蛋白CDS区序列及PPIF基因编码人、牛、非洲爪蟾等CypD蛋白CDS区序列,用MEGA 7.0软件多序列比对,选择保守且长度适合区域,设计简并引物。提取热带念珠菌总RNA反转录成c DNA,利用PCR技术克隆了热带念珠菌CypD基因CDS保守区序列。利用RACE(Rapid amplification of c DNA ends)技术分别克隆CypD基因3’端和5’端序列。结果表明,根据Cyp40和PPIF基因设计的简并引物均能扩增出与预期目的基因大小一致的c DNA片段,且c DNA序列一致。与数据库热带念珠菌XM-00250574.1(CTRG-05018)序列高度一致,推测热带念珠菌CypD蛋白担负着mPTP组分和脯氨酸异构化酶两种功能。(2)CypD生物信息学分析。比较人源肝细胞L02与热带念珠菌的CypD生物信息。结果表明:与人源肝细胞L02的CypD相比,核苷酸序列相似度为64.42%,氨基酸序列同源性为73.58%。热带念珠菌CypD基因c DNA大小为489 bp,蛋白为17.61 k Da;人肝细胞L02细胞CypD基因c DNA大小为624 bp,蛋白为22 k Da,结果表明热带念珠菌CypD蛋白分子量较小、稳定。两者都无跨膜结构,为胞内蛋白,二级结构均以无规则卷曲和螺旋为主;三级结构都有二个α螺旋及八个反平行的β折叠片,都是典型的cyclophilin＿ABH＿like结构域,存在于线粒体中。系统进化树分析表明,CypD基因在哺乳动物、鱼类、真菌中都比较保守,同源性为70%左右。说明不同物种亲环素家族蛋白结构都有高度的保守性。(3)热带念珠菌与人CypD的克隆表达及纯化。体外构建原核表达载体即热带念珠菌p ET28a-CypD,以及人p ET28a-CypD,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。结果在理论范围内表达有目的蛋白,且Western blot检测都能与抗体特异性结合。说明本研究成功构建了原核表达载体。(4)CypD蛋白与CsA相互作用研究。(1)分子对接预测结果显示:热带念珠菌CypD和人肝细胞L02细胞CypD与CsA均以疏水作用结合,对比无显著差异;(2)等温滴定量热实验结果:热带念珠菌CypD与CsA没有相互作用,人CypD与CsA以氢键作用或范德华力相互作用。(3)CsA对CypD酶活性测定显示:CsA对热带念珠菌CypD和人肝细胞L02细胞CypD,都是以浓度依赖型的方式抑制CypD顺反异构酶活性,说明两者CypD都有酶活性。综上所述,热带念珠菌与人CypD存在差异,CsA对热带念珠菌CypD没有相互作用,该结果与CsA不能使抗菌肽CGA-N12诱导热带念珠菌打开的mPTP收缩研究结果一致,推测本研究克隆表达的CypD为热带念珠菌mPTP组分蛋白。