长链非编码RNA AC114812.8在膀胱尿路上皮癌中的作用及其分子机制研究

作     者：李伟健 

作者单位：南京大学 

学位级别：硕士

导师姓名：燕翔

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：膀胱癌 lncRNA miRNA ceRNA EMT 

摘      要：目的:膀胱癌是全球第九大常见的癌症,年发病率约43万例,其死亡率高、发病机制复杂,目前缺乏理想的治疗方式。高级别肌层浸润性膀胱癌患者目前只能被迫接受根治性全膀胱切除,并且术后辅助放、化疗,而这些治疗显著降低了患者术后的生活质量和生存时间,给患者带来了极为沉重的身心负担。因此,为了更有效地防止膀胱癌进展,必须继续深入研究膀胱癌疾病进展的机制。长链非编码RNA(lncRNA)是一类特殊的RNA分子,其长度大于200bp,在转录调控中具有重要意义。本课题组先前通过高通量测序已经确定了一系列在膀胱癌组织异常表达的lncRNA。其中,一条在膀胱癌中显著高表达的lncRNA—AC114812.8引起了我们的关注。本研究旨在揭示其在膀胱中的生物学功能及其机制,为膀胱癌的诊疗提供潜在的治疗靶标。方法:首先,我们通过RT-PCR实验探究了AC114812.8在膀胱癌组织和细胞系中的表达水平,通过核质分离实验和FISH实验明确其亚细胞定位情况。其次,我们通过降低和提升AC114812.8的表达水平来探究其对膀胱癌细胞功能的影响。我们通过CCK-8实验和克隆形成实验来评估膀胱癌细胞的增殖能力;通过Transwell小室实验和划痕实验评估膀胱癌细胞的迁移能力;通过Matrigel小室实验评估膀胱癌细胞侵袭的能力。同时,我们通过动物实验探究了AC114812.8在体内对膀胱癌的影响。再次,我们通过生物信息学分析工具预测了AC114812.8潜在的下游的miRNA,并通过RNA pull down和荧光素酶报告基因实验予以验证。最后,我们又通过生信分析预测了miRNA所调控的靶基因,并通过Western Blot实验和荧光素酶报告基因实验进行了验证。结果:通过q RT-PCR实验,我们发现AC114812.8在膀胱癌中的表达水平显著升高。核质分离实验和FISH实验表明AC114812.8主要定位于膀胱癌细胞质中。克隆形成实验和CCK-8实验结果表明,AC114812.8沉默后膀胱癌细胞的增殖能力显著减弱;相反,AC114812.8的过表达显著促进膀胱癌细胞的增殖。通过Transwell小室、划痕试验和Matrigel小室实验,我们发现AC114812.8沉默后可抑制膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力;相反,过表达AC114812.8后膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力显著增强。在通过体外实验揭示AC114812.8在膀胱癌细胞中的功能后,我们进一步探讨了它是否能在体内有效地调控膀胱癌。动物实验结果显示AC114812.8过表达组的小鼠肿瘤体积和重量明显高于对照组。此外,我们利用生物信息学分析预测了AC114812.8可能结合的miRNA,发现mi R-371b-5p可能是潜在的miRNA。同时,荧光素酶基因报告实验和RNA pull down结果也进一步证明了AC114812.8和mi R-371b-5p之间的直接结合。借助mi Randa和Target Scan数据库,我们预测了mi R-371b-5p潜在的下游靶基因,我们发现mi R-371b-5p和FUT4的3’UTR区域结合的可能性较高。为了验证这一预测,我们进行了荧光素酶报告基因实验,结果表明mi R-371b-5p可以结合到FUT4 3’UTR区域发挥调控功能。为了验证我们的结果,我们进行了挽救实验。结果表明,mi R-371b-5p可以挽救AC114812.8对FUT4表达水平和膀胱癌细胞增殖、迁移能力的增强效果。最后,我们用Western Blot分析了AC114812.8对膀胱癌细胞中EMT相关基因表达的影响。结果表明,AC114812.8过表达组的β-catenin、Slug、Ncadherin和Vimentin的表达水平明显升高,表明AC114812.8在膀胱癌中促进了EMT进程。结论:我们的研究表明,AC114812.8可以通过充当mi R-371b-5p海绵,抑制mi R-371b-5p对靶基因FUT4的沉默作用,从而调控FUT4促进膀胱癌的进展,我们的结果为膀胱癌提供了潜在的诊断的肿瘤标志物和开发治疗药物的靶点。