捕食线虫真菌中少孢素生物合成基因簇上的非合成基因功能的表征

作     者：岳熙桐 

作者单位：云南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：牛雪梅

授予年度：2022年

学科分类：0710[理学-生物学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 

主      题：少孢节丛孢 PKS-TPS基因簇 非生物合成基因 功能鉴定 

摘      要：少孢节丛孢(Orbilia oligospora)是捕食线虫真菌中可以产生一类特有的杂合生源信号小分子化合物—少孢素类化合物(Arthrosporols),其参与调控真菌形态和土壤定殖。本实验室前期鉴定了少孢素类化合物生物合成的基因簇AOL＿s00215g上的9个关键生物合成基因274,276-283,但在簇上邻近的非生物合成基因284-286功能尚不清楚。因此采用同源重组的方法对这三个基因分别进行敲除,成功获得基因敲除菌株Δ284,Δ285,Δ286。通过比较突变菌株和WT的生长速率、捕器产量、产孢数量、透射电镜、抗逆性实验、FM4-64和CFW染色观察,TCA和氨基酸含量测定,氨含量测定,代谢物检测,代谢组与转录组学分析,RT-q RCR检测273-283的表达量,少孢素含量检测等,鉴定284-286的功能并解析其与少孢素生物合成基因簇的关联。主要结果如下:1、代谢分析发现,284-286基因的敲除均能影响少孢素的含量变化,Δ284和Δ286的少孢素含量均降低,而Δ285的少孢素化合物含量增加了两倍,此外Δ286中2/3的代谢峰消失。Δ284泛素化水平检测发现其蛋白泛素化水平和自噬水平显著提高,表明284可能参与对少孢素的合成基因蛋白的去泛素化从而调控少孢素含量。对Δ285进行非靶标代谢组学分析,发现Metabolic Pathways富集到t RNA代谢-Adenosylcobalamin biosynthesis,该通路生成卟啉,卟啉是少孢素合成基因277编码的cupin蛋白参与反应所必须的辅助因子,这也与转录组学分析发现277表达量显著上调94倍相一致,表明缺失285编码的t RNA甲基转移酶导致277的表达量升高,从而导致少孢素上升;Δ286中少孢素含量下调可能是真菌的生长受到了严重抑制。2、表型分析发现Δ284和Δ285的捕器数量增多,而Δ286的捕器减少。转录组学分析发现,Δ284和Δ285上调基因KEGG富集最显著的均是组氨酸代谢,而Δ286是色氨酸代谢。以上结果表明,Δ284和Δ286中少孢素含量与捕器产量呈相反的趋势,与前期研究相一致。在284和286敲除菌株中组氨酸和氨含量上调均上调,与捕器含量上调一致,表明组氨酸上调与捕器上调有相关性。3、比较11个生物合成基因敲除的突变菌株Δ273-Δ283中284-286基因的转录差异,发现Δ283中284的表达量最低,285和286在11个突变菌株中变化趋势一致,结合Δ285和Δ286中277表达量上调最为显著,表明285和286可能共同作用于277,从而调控少孢素生物合成基因簇的表达。本论文表明少孢素生物合成基因簇上的非合成基因284-286不仅调控少孢素的生成,同时参与调控捕器生成和菌丝成长。为生物合成基因簇上非合成基因功能的作用和表征鉴定提供了参考。