壳聚糖-Pickering乳液/白细胞介素-12佐剂体系增强沙眼衣原体Pgp3蛋白的免疫保护效果及其机制研究

作     者：舒明艺 

作者单位：南华大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李忠玉

授予年度：2022年

学科分类：1001[医学-基础医学(可授医学、理学学位)] 100102[医学-免疫学] 10[医学] 

主      题：沙眼衣原体 Pgp3蛋白 壳聚糖-Pickering乳液 白细胞介素(Interleukin)-12 免疫保护作用 

摘      要：背景:沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种专性胞内寄生、高度流行的病原体,可感染人引起多种疾病,严重危害人类健康。且感染常因无症状容易导致诊疗延迟,治疗后也极易复发,因此,寻求有效疫苗是预防和控制Ct感染的根本措施。早期研究表明Ct质粒编码Pgp3是一种免疫优势蛋白,但其产生的免疫反应不足以抗Ct感染,需要佐剂增强该疫苗的免疫反应。有效的佐剂应该包括蛋白递送和免疫增强两方面,Pickering乳液在靶向递送抗原方面有着巨大潜力,它是利用疏水固体微粒作为乳化剂稳定两相界面形成的乳浊液,合适的乳化剂对于形成稳定乳液体系非常重要。壳聚糖(Chitosan,CS)颗粒具有良好的生物相容性和低毒性,可稳定两相界面形成稳定的壳聚糖-Pickering乳液(CS-Pickering),是合适且高效的乳化剂。此外,IL-12因其独特的生物学效应可作为一种免疫增强剂。因此,利用CS-Pickering和IL-12的佐剂特性形成佐剂体系增强Pgp3蛋白疫苗的免疫水平,这对于预防和控制Ct感染具有重要的价值和意义。目的:以Pgp3蛋白搭配CS-Pickering/IL-12佐剂体系制备成疫苗免疫小鼠,检测该疫苗对感染鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)小鼠模型的免疫保护力,探讨CS-Pickering/IL-12和Pgp3蛋白在沙眼衣原体疫苗研究中的应用价值。方法:将CS水相与油相混合,利用超声功率、p H、CS颗粒浓度、水油体积比和油相种类对乳液制备的影响,优化制备出CSPickering。此外,通过检测乳液对抗原的装载量以及巨噬细胞摄取抗原能力,体外评估CS-Pickering的佐剂潜力。CS-Pickering与IL-12构建为CS-Pickering/IL-12佐剂体系,搭配Pgp3蛋白形成疫苗。选择4周龄雌性BALB/c小鼠,随机进行实验分组后于0、2、4周免疫三次,组别设置为PBS组、Pgp3组、CS-Pickering/Pgp3、IL-12/Pgp3和CS-Pickering/IL-12/Pgp3。利用酶联免疫吸附测定(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测免疫后第2、4、6周小鼠血清抗体水平(包括Ig G、Ig G1和Ig G2a);利用ELISA检测免疫后第6周的小鼠阴道灌洗液分泌型Ig A(s Ig A)水平;在免疫后第6周收集小鼠脾细胞,检测Pgp3刺激脾细胞后上清分泌的细胞因子(IL-4、IFN-γ、TNF-α和IL-2)水平,同时利用CCK8试剂盒检测脾细胞增殖能力。第三次免疫后一个月,各组小鼠阴道后穹隆接种Cm菌株,攻毒后每隔3或4天收集小鼠阴道分泌物,利用IFA检测各组小鼠下生殖道的Cm载量;攻毒后第60天处死小鼠分离取出子宫组织,肉眼观察输卵管水肿情况并评分,然后进一步制备石蜡切片并用H-E染色,对子宫进行病理损伤观察;利用CCK8试剂盒检测乳液对巨噬细胞毒性作用,以及利用生化分析仪检测免疫小鼠血清生化指标包括乳酸脱氢酶(LDH)、谷丙转氨酶(ALT)、尿素氮(BUN)、谷草转氨酶(AST)和碱性磷酸酶(ALP),评估疫苗佐剂的生物安全性。结果:1.优化制备出的CS-Pickering乳液平均Size为789.47±44.26nm、平均Zeta电位为33.2±3m V和PDI为0.427±0.12(P0.05)。2.罗丹明(Rh B)标记的CS颗粒制备出的乳液,通过荧光显微镜观察乳液微观形态,可知CS主要位于液滴表面。3.乳液与模式抗原异硫氰酸荧光素标记牛血清白蛋白(FITCBSA)孵育后,观察到液滴的表面发出绿色荧光,推测CS-Pickering乳液以吸附的方式装载蛋白;且测出乳液对Pgp3抗原的吸附率为89.04±3.8%(P0.05)。4.吸附FITC-BSA的CS-Pickering乳液与巨噬细胞孵育,荧光染色后,结果显示吸附带有FITC-BSA的CS-Pickering乳液组的巨噬细胞内有荧光乳滴,表明巨噬细胞能够摄取CS-Pickering/FITCBSA。5.比较血清特异性抗体(Ig G、Ig G1和Ig G2a)和小鼠生殖道分泌物s Ig A水平。结果显示,与Pgp3组相比,CS-Pickering/IL-12佐剂能够显著增强针对Pgp3蛋白的各抗体水平(P0.05)。6.比较各组小鼠末次免疫2周后的脾细胞增殖能力和脾细胞上清细胞因子水平(IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-2)。结果显示,与其它组别相比,CS-Pickering/IL-12佐剂体系能够促进小鼠脾细胞的增殖能力(P0.05);CS-Pickering/IL-12/Pgp3免疫组的IFN-γ、IL-2、TNF-α和IL-4高于PBS组和Pgp3疫苗组,且CS-Pickering/IL-12佐剂组IFN-γ分泌水平分别比CS-Pickering和IL-2佐剂组高出5倍和2倍(P0.05),TNF-α分泌水平分别比CS-Pickering和IL-2佐剂组高出2倍和3倍(P0.05),而IL-2分泌水平比IL-2佐剂组高17%。7.小鼠攻毒后各组下生殖道Cm载量比较,结果显示CSPickering/IL-12佐剂组在感染第17天衣原体载量显著下降,并于攻毒后21天清零。8.处死攻毒后的小鼠,取出子宫组织评估输卵管积水和组织病理损伤情况,结果表明CS-Pickering/IL-12佐剂组小鼠没有明显的输卵管积水和炎症细胞浸润。9.安全性评估显示,乳液对巨噬细胞没有明显毒性,各组小鼠血清生化指标并无变化,佐剂疫苗具有良好的生物安全性。结论:CS-Pickering/IL-12佐剂体系能够显著增强针对Pgp3抗原的体液免疫和细胞免疫反应,减轻感染Cm小鼠输卵管积水和炎症病理损伤,产生良好的免疫保护作用。