西瓜ClMBD家族成员的鉴定、表达模式和抗病功能研究

作     者：梁珈语 

作者单位：浙江大学 

学位级别：硕士

导师姓名：宋凤鸣

授予年度：2022年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 

主      题：西瓜 甲基化CPG结合结构域蛋白(Methyl-CPG-Binding Domain,MBD) 表达模式 DNA甲基化 转基因拟南芥 抗病反应 

摘      要：Methyl-CPG-Binding Domain(MBD)蛋白能结合甲基化DNA,抑制特定基因的转录表达,从而在植物生长发育和响应非生物胁迫反应中起重要作用。本研究鉴定了瓜类MBD家族成员,克隆了西瓜ClMBD家族10个基因,研究了ClMBD的表达模式、生化活性,并通过拟南芥异位表达的方式研究了 ClMBD基因的抗病功能。主要结果如下:在瓜类作物基因组中鉴定到10个西瓜ClMBD基因、9个甜瓜CmMBD基因、10个黄瓜CsMBD基因、15个西葫芦CpMBD基因和16个南瓜CmoMBD基因,并克隆获得10个ClMBD基因。根据序列的系统发育树关系,西瓜ClMBD蛋白分为2组,全部瓜类作物MBD蛋白存在相对应的系统发育树关系。在西瓜基因组中检测到ClMBD1/3等7个基因对的基因复制事件。西瓜ClMBD和拟南芥、甜瓜、黄瓜、西葫芦、南瓜MBD基因之间分别存在9、15、20、19和26个共线性基因对。瓜类MBD基因具有相似的结构,但外显子和内含子数量不尽相同。瓜类MBD蛋白均具有1个或2个保守的MBD结构域,部分瓜类MBD蛋白还存在Zf-CW和PHD等结构域。所有西瓜ClMBD蛋白定位于细胞核,ClMBD2和ClMBD3分别与ClIDM2(Increased DNA Methylation 2)和 C1IDM3 在细胞核内发生互作;ClMBD2 能特异性地结合mCG DNA,但不能结合mCHG DNA或mCHH DNA;其他ClMBD蛋白不能结合甲基化DNA。西瓜ClMBD基因在叶部表达量最高,茎部次之,根部最低。水杨酸(salicylic acid,SA)处理后,ClMBD基因在处理后不同时间点显著上调。茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)处理后,ClMBD2、6、7、8和10显著上调表达,ClMBD5和9显著下调表达。西瓜植株根部接种枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.***.niveum)后,大多数ClMBD基因在接种后第6d或第9d时显著上调。西瓜植株叶片接种蔓枯病菌(Didymella bryoniae)后,ClMBD3、4、7和9显著上调表达,ClMBD2、6、8和10基因显著下调表达。创制获得了过表达单个ClMBD基因的转基因拟南芥株系ClMBD-OE,各ClMBD基因在其ClMBD-OE株系植株中均能正常转录表达。过表达ClMBD基因的拟南芥植株与野生型相比,在株高、叶型和大小等方面无明显差异。离体叶片接种和活体喷雾接种灰霉病菌(Botrytis cinerea)后,ClMBD2-OE、ClMBD3-OE和ClMBD5-OE植株对B.cinerea的抗性减弱,防卫基因AtPDF1.2的表达下调,但活性氧(reactive oxygen species,ROS)积累增加,说明ClMBD2、3和5负调控拟南芥对B.cinerea的抗性。叶片注射接种Pseudomnas syrinage pv.tomato(Pst)DC3000 后,ClMBD1-OE、ClMBD2-OE 植株病害症状加重,防卫基因AtPR1的表达水平显著下调,而ClMBD5-OE植株的病害症状减轻,AtPR1的表达水平显著上调,说明ClMBD1、ClMBD2负调控而ClMBD5正调控拟南芥对Pst DC3 000的抗性。利用RNA-seq技术分析了正常生长的4周龄ClMBD2-OE2和野生型拟南芥植株的转录组,以表达量差异1.5倍且P-value0.05为标准,在ClMBD2-OE2中鉴定到70个差异表达基因(52个上调差异表达基因、18个下调差异表达基因)。在差异表达基因中,包含一些已知参与拟南芥免疫反应的基因,如AtWRKY18、AtWRKY30等。使用qRT-PCR验证了 10个差异表达基因在接种B.cinerea和Pst DC3000前后的表达变化。结果表明,在正常生长的ClMBD2-OE植株中,AtWRKY18、AtWRKY30等基因显著上调表达,而AtMAF5、AtBEE1等基因则显著下调表达;接种B.cinerea后,与野生型相比,ClMBD2-OE植株中AtWRKY18和AtbZIP34显著上调表达,而AtANAC019和AtBEE1显著下调表达;接种Pst DC3000 后,ClMBD2-OE 植株中 AtWRKY18、ATERF54、AtMAF5、AT5G52190和AtBEE1显著下调表达。这些结果表明ClMBD2能调控部分拟南芥免疫相关基因的表达。