千层金MbEGS/MbIGS基因在甲基丁香酚生物合成中功能的初步分析

作     者：林永盛 

作者单位：福建农林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李永裕;杨超

授予年度：2022年

学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学] 

主      题：千层金 丁香酚合成酶 瞬时表达 基因沉默 分子对接 

摘      要：千层金(Melaleuca bracteata ***.)是桃金娘科(Myrtaceae)白千层属(Melaleuca L)常绿乔木,是具有较高观赏价值的彩叶树种,千层金中挥发性物质甲基丁香酚的含量极高,叶片精油中甲基丁香酚的相对含量可高达90.46%。因此,千层金植株是研究甲基丁香酚生物合成途径的良好材料。目前,国内外关于千层金繁殖栽培技术、精油提取及成分分析等方面已有相关研究,但关于千层金挥发性香气合成途径中分子调控机制的研究报道还比较少。因此,本研究以千层金扦插苗为试验材料,通过病毒诱导基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、瞬时表达技术、同源建模与分子对接技术,研究甲基丁香酚生物合成途径中丁香酚合成酶基因和异丁香酚合成酶基因功能的初步分析,主要研究结果如下:1.采用农杆菌介导法,将构建好的过表达载体pCam1304-MCS35S-MbEGS1和pCam1304-MCS35S-MbEGS2,转化至千层金枝条。通过qRT-PCR和GC-MS分析过表达MbEGS基因对甲基丁香酚生物合成途径上关键基因转录水平和甲基丁香酚含量的影响,结果表明,MbEGS1基因过表达处理组中,MbEGS1基因转录水平较空载组提高了13.46倍,甲基丁香酚含量上升了18.68%。MbEGS2过表达处理组中,MbEGS2基因转录水平较空载组提高了12.47倍,甲基丁香酚含量上升16.48%。证明MbEGS基因是千层金甲基丁香酚生物合成途径中的关键基因。2.利用VIGS载体pNC-TRV2构建千层金MbEGS1和MbEGS2的基因沉默载体pNC-TRV2-MbEGS1和pNC-TRV2-MbEGS2,通过农杆菌介导法和真空渗透法侵染千层金扦插苗。结果表明,MbEGS1基因处理组中,MbEGS1转录水平较空白对照组(CK)和空载对照组分别下降76.10%、79.48%;MbEGS2和MbIGS基因转录水平则分别提高了33.64倍、30.94倍和2.55倍、2.27倍。而在MbEGS2基因处理组中,千层金MbEGS2基因转录水平较CK组和空载组分别下降89.53%、90.35%;MbEGS1和MbIGS基因转录水平则分别提高了3.79倍、3.11倍和27.27倍、25.26倍。甲基丁香酚含量测定结果表明,MbEGS1基因处理组中,甲基丁香酚含量比CK组和空载组分别下降31.91%和28.04%;MbEGS2基因处理组则分别下降23.79%和19.45%。MbEGS基因转录水平的下调不仅导致千层金中甲基丁香酚含量下降,还致使MbIGS基因转录水平上调,表明MbEGS基因是甲基丁香酚合成途径的关键基因且和MbIGS基因存在底物竞争关系。3利用RT-PCR技术从千层金中克隆得到1条异丁香酚合成酶基因(MbIGS),其编码区长度为657bp,编码218个氨基酸,序列比对和系统进化树分析表明,MbIGS编码的氨基酸序列与巨桉(Eucalyptus grandis)Eg IGS1、麻疯树(Jatropha curcas)Jc IGS1、银白杨(Populus alba)Pa IGS1分别具有57.89%、52.35%、51.10%的同源性。采用pCam1304-MCS35S瞬时表达载体,构建MbIGS的过表达载体pCam1304-MCS35S-MbIGS,通过农杆菌介导法转化千层金枝条。结果表明,MbIGS的转录水平较空载组提高了12.23倍,而甲基丁香酚的含量提高了43.41%,在MbIGS基因过表达处理组中检测到0.15 mg·g微量的丁香酚与异丁香酚混合物,但并未检测到甲基异丁香酚的存在。由此,推测千层金MbIGS基因可能是一个具有双功能性的基因,既可以催化乙酸松柏酯生成异丁香酚,也可以催化乙酸松柏酯生成丁香酚。4.利用SWISS-MODEL与Auto Dock Tools软件对千层金MbEGS和MbIGS进行蛋白质三维结构建模与分子对接。结果表明,MbEGS1与乙酸松柏酯在Asn157、Phe159和Tyr162处形成氢键,最低结合能为-6.11kcal/mol,MbEGS2分别在Phe22、Gly23、Thr90、Phe120和Phe162处形成氢键,最低结合能为-6.01kcal/mol,而MbIGS则分别在Leu66、Val76、Thr133和Arg135处形成氢键,最低结合能为-6.38kcal/mol。其中,Phe159、Phe22、Gly23、Phe120、Phe162、Leu66和Val76为疏水性氨基酸,疏水性氨基酸可以在对接结合口袋中形成疏水作用,而疏水作用可进一步加强配体小分子与蛋白质大分子结合,有利于配体小分子稳定结合在蛋白质的活性口袋中。表明千层金MbEGS和MbIGS与底物作用的结合位点