麦红吸浆虫蜕皮激素受体EcR和超气门蛋白USP两个亚型的表达及与滞育和发育变态的关系

作     者：刘禹含 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：成卫宁

授予年度：2019年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：麦红吸浆虫 滞育 20-羟基蜕皮酮 蜕皮激素受体 超气门蛋白 

摘      要：类固醇激素20-羟基蜕皮酮(20E)在昆虫的发育变态、生殖和滞育等生命活动过程起着重要的调节作用。蜕皮激素受体EcR和超气门蛋白USP是20E的作用靶标,二者形成异源二聚体相互作用,在20E的信号传导中发挥着重要作用。研究发现,EcR最多可编码A、B1和B2三种蛋白亚型,USP可编码A和B两种蛋白亚型;不同亚型的EcR和USP在昆虫生命活动中的表达模式、结合方式和功能不同。麦红吸浆虫Sitodiplosis mosellana(Géhin)是重要的农业害虫,同时是一种典型的专性滞育昆虫。本研究的目的是明确麦红吸浆虫EcR和USP亚型的种类;通过分析它们的分子结构、在滞育和发育进程及20E处理下的mRNA的表达模式及蛋白的表达方式,弄清对滞育和发育的调控机理。主要结果如下:1.采用比较基因组学方法,系统分析了已完成全基因组测序的6个目13种代表昆虫的EcR与USP亚型。以获得的其它昆虫EcR与USP序列为模板,通过Blast检索已获得的麦红吸浆虫转录组数据库,初步明确麦红吸浆虫具有1个EcR和2个USP(USP-A,USP-B)编码基因;***-PCR获得了SmEcR、SmUSP-A和SmUSP-B的开放阅读框,长度分别为1,563、1,377和1,314 bp,分别编码520、458和437个氨基酸,编码蛋白分子量分别为59.6、51.6和49.2 kDa,理论等电点分别5.51、9.00和8.78;多序列比对分析显示,麦红吸浆虫EcR与USP蛋白具有典型的核受体超家族结构特征,即A/B域(反式激活域)、C域(DNA结合域)、D域(铰链域)和E域(激素配体结合域)。其中,USP-A与USP-B的氨基酸序列相似性为76.42%,二者主要区别在A/B域,分别包含106和85个氨基酸。***、SmUSP-A和SmUSP-B在麦红吸浆虫幼虫滞育进程中的表达变化趋势总体一致且与滞育阶段密切相关,即进入滞育后表达量显著降低,滞育维持期一直很低,但大部分幼虫滞育终止后表达量显著提高,直到翌年破茧恢复发育的前期表达显著下降。说明三个基因的表达与滞育的启动、终止及滞育后静息阶段的维持有关,两种SmUSPs可能同时与SmEcR形成异源二聚体在滞育过程中发挥作用。4.麦红吸浆虫幼虫—成虫的发育过程中,SmEcR、SmUSP-A和SmUSP-B的表达变化趋势也一致,即化蛹前3龄后期幼虫表达量显著高于其它发育阶段,其次为预蛹期;雌成虫表达量均略高于雄虫。推测三个蛋白可能同时相互作用在幼虫到蛹的变态和成虫的生殖过程中发育作用。5.为明确麦红吸浆虫滞育期间SmEcR和SmUSPs对20E的响应,分析了不同浓度(0.1～0.6 pg/nL)20E处理滞育幼虫1和3 h后三个基因表达水平变化。结果显示,20E处理对三个基因的表达均有诱导作用,但诱导效应与时间和应用浓度密切相关。即3 h后的诱导作用强于1 h;3 h后,在0.1-0.4 pg/nL浓度范围内,三个基因表达量均随着浓度的增大而升高,即在0.4 pg/nL时诱导作用最强。6.构建了麦红吸浆虫EcR与USP基因的双分子荧光互补与免疫共沉淀瞬时表达质粒。在转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞36 h后,Western blot分析表明,N-端融合m Cherry不同结构域(Nm,Cm)的EcR与USP均未表达;随后的分析表明,尽管N-端融合HA标签的USP蛋白可以在转染的Sf9细胞中表达,但N-端融合Myc标签的EcR仍未表达。推测异源表达系统(鳞翅目Sf9细胞)可能影响麦红吸浆虫EcR与USP的表达;抑或N-端融合标签影响EcR与USP的空间构象折叠或融合蛋白稳定性。